青海地区马铃薯表面附着乳酸菌多样性的研究

张志霞，施环宇，孙岩岩，谈重芳，张 淼，崔美岩，王雁萍，李宗伟

（郑州大学 河南省离子束生物工程重点实验室，河南 郑州 450001）

0 引言

马铃薯是茄科属多年生块茎草本植物，具有产量高、生育期短、营养丰富、消化率高等特性[1].马铃薯的茎叶柔嫩且多汁，具有较好的饲料应用潜质，在我国青藏高原地区有广泛的种植基础.

乳酸菌（LAB,lactic acid bacteria）不是分类学上的名词，而是指一群可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称[2].这类细菌在自然界分布极为广泛，具有明显的物种多样性.近年来对青藏高原地区乳酸菌的研究大部分为乳制品方面的[3-5]，相对比植物自然附着的乳酸菌的研究少，因此需要对植物附着乳酸菌的多样性进行进一步的研究.

作者以青海部分地区马铃薯植株为对象，分离鉴定了其表面附着的乳酸菌，并分析了不同来源样品中乳酸菌在数量和种类上的差异.一方面评估青海地区马铃薯自然附着乳酸菌的多样性，丰富乳酸菌菌种；另一方面为食品和饲料发酵提供乳酸菌菌种资源.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集及处理

2012 年9 月从中国青藏高原青海省部分地区采集马铃薯植株及其根系土壤，样品采集地与分离到的乳酸菌株见表1.为了分析样品茎叶和根附生乳酸菌的差异，每个样品的茎叶和根被视为不同样品种类.所有样品均由无菌剪刀剪碎，然后各取10 g 加入装有90 mL 灭菌水的锥形瓶中，在漩涡振荡器上振荡均匀后，稀释5 个梯度，然后各取20 μL 10-1、10-3和10-5倍样品稀释液分别涂布在MRS 培养基上，30 ℃恒温厌氧培养48 h.进行菌落计数，并且根据菌落大小、形态和颜色等特征，挑取单菌落在MRS 培养基上划线纯化两次，-80 ℃下保存在10%二甲基亚砜的NB 培养基中备用[6].

1.1.2 主要试剂和仪器

培养基：MRS 肉汤培养基（Difco Laboratories,Detroit，MI，USA）；Nutrient Agar 培养基（Nissui Ltd.，Tokyo，Japan）；Agar(Nissui Ltd.，Tokyo，Japan）.以上培养基pH 均为6.5～7.0，固体培养基琼脂粉加入量为1.5%.

PCR 扩增仪（Thermo Arktik）：美国赛 默飞；Bio -Rad GelDocTMXR 凝胶成像仪、Bio -Rad PoweePac Basic 电泳仪：美国伯乐.

表1 马铃薯表面附着乳酸菌分布情况Table 1 The diversity of lactic acid bacteria associated with potato

1.2 菌株生理生化特征测定

1.2.1 形态特征

包括单菌落的形状、大小、光泽、颜色、突起等一些表面特征，同时通过显微镜观察细胞形态特征.

1.2.2 生理生化特征

菌株检测的生理特征主要有耐盐（NaCl）浓度、pH 范围生长、温度范围生长试验，使用紫外分光光度计测定其生长状况值.耐盐浓度试验测定：在含有3.0%和6.5%（W/V）NaCl 的液体MRS 培养基（pH 6.5）中分别接种菌株，放置于普通恒温培养箱（30 ℃）中培养48 h，对照组为0%NaCl.pH 范围生长试验测定：分别在pH 为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、9.0、10.0 的MRS 液体培养基中接种单菌落，放置于普通恒温培养箱（30 ℃）中培养7 d与对照组（pH 6.5）相比.温度范围生长试验测定：在液体MRS 培养基（pH 6.5）中接种菌株，分别放置于5、10、45、50 ℃下培养，其中45 ℃和50 ℃下培养7 d，5 ℃和10 ℃培养14 d，对照管为30 ℃（7 d）.

菌株测试的生化特征主要包括：过氧化氢酶试验、发酵葡萄糖产气试验（同型或异型发酵试验）、碳源发酵试验等，具体试验方法见参考文献[7].

1.3 菌株PCR 扩增

采用菌落PCR 法，扩增16sRNA 的部分基因.使用固体纯化法培养出实验菌株单菌落后，挑取单菌落加入PCR 反应体系中.PCR 反应体系为50 μL：Premix Taq 25 μL，正向和反向引物（均为20 μmol·L-1）1 μL，补充双蒸水至50 μL，16 sRNA片段的扩增引物为通用引物 27F (5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’).反应条件为94 ℃30 s、55 ℃30 s 以及72 ℃90 s，35 个循环，72 ℃10 min.以不加单菌落的体系做阴性对照，1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统下观察结果.

将无法用菌落PCR 扩增出条带的菌株用细菌全基因组提取试剂盒提取其DNA 后再进行PCR反应，反应体系为50 μL：Premix Taq 25 μL，DNA模板5 μL，27 F 和1 492 R（均为20 μmol·L-1）1 μL，补充双蒸水至50 μL，反应条件与菌落PCR 条件一致，电泳检测条件也一样.

1.4 16S rDNA 序列分析及系统进化树的构建

将菌落PCR 和DNA 提取后的PCR 产物送到华大基因公司测序，将测序所得1 500 bp 左右的16S rDNA 序列在GeneBank 中使用程序Blast 寻找与其最大同源性的的序列.如果测序菌株与标准菌株间的16S rDNA 同源性值在97.5% 以上，一般就可判定它们属于同一个种.将测序所得的序列和Blast 所得的标准序列导入CLUSTAL W 软件进行比对后，用MEGA5.0 软件中的邻接法（neighborjoining method）构建进化树[8].进化树的拓扑结构采用序列数据的步长分析法进行1 000 次随机采样估算[9]，并且将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NCDO 1769T 作为外围菌株.

2 结果和分析

2.1 马铃薯表面自然附着的乳酸菌的分布状况

从青海省10 个不同地点采集了10 份马铃薯样品，并对每份样品的茎叶和根部分开处理.如表1 所示，从巴燕镇采集到的9-23-7 号样品茎叶中没有分离出乳酸菌，而其根系土壤中检测到的乳酸菌，其数量为104CFU/g，而采集自互助县的9-25-3 号样品却是只在茎叶中分离到了乳酸菌，数量为105CFU/g，其余8 个地点采集到的马铃薯样品茎叶处理和根部处理均分离出乳酸菌.其中9-26-10、9-23-2、9-24-6 号样品分离到了较多形态学上不同的乳酸菌，整体上根部分离到的乳酸菌类型相对多于茎叶.10 份样品都成功分离到了乳酸菌，可以看出青海部分地区马铃薯自然附着的菌株广泛存在乳酸菌.

2.2 马铃薯样品中乳酸菌的生理生化性状

马铃薯样品中乳酸菌代表菌株生理生化特征如表2 所示，所有的代表菌株都是革兰氏反应阳性、过氧化酶反应阴性的球菌，根据分离到的乳酸菌形态学特征和生理生化特征及鉴定结果将马铃薯样品中乳酸菌分为5 组（PA-PE），表中的菌株为每个分组的代表菌株.PA 组乳酸菌包含菌株qz-543、qz-771、qz-770、qz-772、qz-279、qz-280、qz-768、qz-594、qz-769、qz-278、qz-695、qz-275x、qz-274、qz-544、qz-568、qz-545、qz-569、qz-570、qz-275d、qz-349、qz-658、qz-698 和qz-700，PB 组包含乳酸菌菌株qz-277、qz-346 和qz-660，PC 组包含乳酸菌菌株qz-596、qz-593、qz-655、qz-571 和qz-242，PD 组包含乳酸菌菌株qz-598、qz-766、qz-602、qz-301、qz-657 和qz-767，PE 组包含乳酸菌菌株qz-240、qz-239、qz-603、qz-348、qz-347、qz-241 和qz-661.

表2 马铃薯代表菌株生理生化特征Table 2 Characteristics of lactic acid bacteria strains isolated from the samples of potat

如表2 所示，PA 组的代表菌株在pH 值9 和10 的表现为不能生长或生长较弱，在温度50 ℃时生长微弱，而在试验的两个NaCl 浓度、pH 值3～8以及温度5、10、45 ℃条件下生长良好.由于PA 组包含较多菌株，不同菌株间会存在一定的差异，表2 只显示了PA 组代表菌株的生理生化特征.PB 组乳酸菌代表菌株能够在5、10、45、50 ℃，3.0%NaCl和pH 值4～9 的条件下生长良好，而在相对高浓度的NaCl 及高pH（10）条件下不能生长，在pH 3.5及以下时生长较弱.PC 组乳酸菌代表菌株10 ℃、3.0%NaCl、pH 值3～9 之间生长良好，5、45、50 ℃；6.5%NaCl 的条件下生长微弱，pH 值10 时不能生长.PD 组乳酸菌代表菌株整体表现良好，只有在50 ℃表现较弱.PE 组乳酸菌代表菌株在50 ℃、pH值3～4.5 条件下生长微弱，在5、10、45 ℃，3.0%和6.5%NaCl、pH 值5～10 的条件下生长良好.

PA 组和PB 组乳酸菌代表菌株能够发酵葡萄糖产气，为异型发酵菌株，而PC 组、PD 组和PE 组不能发酵葡萄糖产气，是同型发酵菌株.

2.3 马铃薯样品中乳酸菌代表菌株碳源发酵特性

马铃薯样品中所分离乳酸菌代表菌株的碳源发酵特性如表3 所示，所有的菌株都不能发酵利用赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、核糖醇、β-甲基木糖苷、山梨糖、半乳糖醇、纤维糖、菊糖、木糖醇、D-来苏糖、D-海藻糖、L-海藻糖和L-阿拉伯醇作为碳源；所有的菌株都能发酵利用葡萄糖作为碳源.

表3 马铃薯样品中乳酸菌代表菌株碳源发酵Table 3 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strainsisolsted from the samples of potatoa

2.4 马铃薯样品中乳酸菌代表菌株16S rRNA 基因序列分析

由马铃薯样品分离到的乳酸菌代表菌株16 S rRNA 系统进化树如图1 所示，利用16S rRNA 基因序列blast 结果和系统进化树图分析，PA 组和PB 组乳酸菌被鉴定到Leuconostoc 属，并且PA 组鉴定为Ln.mesenteroides 种，系统进化树并不能把PA 组鉴定到亚种水平，需进一步探讨.结合Masanori 等[10]研究结果分析，如表3 所示，乳酸菌菌qz-569、qz-570 和qz-275 不能够利用阿拉伯糖和纤维二糖碳源发酵，能够利用蔗糖和海藻糖发酵，与标准菌株Ln.mesenteroides subsp.dextranicum JCM 9700T一致，可以将这4 株菌株鉴定为Ln.mesenteroides subsp.dextranicum，而乳酸菌菌株qz-594 和qz-279 能够利用阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖和海藻糖碳源发酵，与标准菌株Ln.mesenteroides subsp.mesenteroides JCM 6124T一致，所以可以将这2 株菌鉴定到Ln.mesenteroides subsp.mesenteroides.而PB 组代表菌株却能够直接鉴定到Ln.lactis，并且qz-277 的blast 结果为99%而qz-346 和Ln.lactis 的同源性是100%.PC 组乳酸菌代表菌株认定为Lactococcus 属，系统进化树能够将PC 组乳酸菌菌株鉴定到L.lactis，却不能将PC 组菌株鉴定到亚种的水平.依据Masanori 的研究工作，如表3 所示，乳酸菌菌株qz-596 和qz-242 均能利用乳糖、半乳糖、麦芽糖和核糖碳源发酵，与标准菌株L.lactis subsp.lactis JCM 5805T一致，因此，可以将乳酸菌菌株qz-596 和qz-242 鉴定为L.lactis subsp.lactis，乳酸菌菌株qz-655 不能利用乳糖、半乳糖、麦芽糖和核糖碳源发酵，与标准菌株L.lactis subsp.hordniae JCM 1180T一致，所以能够将乳酸菌菌株qz-655 鉴定成L.lactis subsp.hordniae.从进化树上可以看出PD 组和PE组乳酸菌属于Enterococcus 属，其中PD 组乳酸菌可以确定为E.mundtii，bootstrap 值达到100%，而PE 组乳酸菌定位到E.gallinarum，且blast 显示的序列同源性都在99%以上.

图1 马铃薯样品分离乳酸菌16S 系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationship between the 16S rRNA gene sequences of strains

3 讨论

从青海部分地区马铃薯表面附着的乳酸菌分布（表1）来看，不同地区采集到的新鲜马铃薯样品大部分都存在乳酸菌，其数量介于6.5×103到3.2×108CFU/g），只有两份处理组没有检测到有乳酸菌的存在.分离到的乳酸菌被归为3 个属，分别为Leuconostoc（60%）、Lactococcus（14.3）和Enterococcus（25.7%），分属于7 个种或者亚种分别为Ln.mesenteroides subsp.dextranicum、Ln.mesen-teroides subsp.mesenteroides、Ln.lactis、L.lactis subsp.lactis、L.lactis subsp.hordniae、E.mundtii 和E.gallinarum.对比来说，明串珠菌一般多存在于乳制品中，而在植物中较少发现，与西藏地区藏蒿草附着乳酸菌比较[12]，其分离到的乳酸菌鉴定为2 个属3 个种，分别为Ln.mesenteroides subsp.mesenter-oides、W.cibaria 和W.confuse，而本研究中青海部分地区的马铃薯附生的乳酸菌菌种相对更丰富.目前大多数研究中，乳酸菌的多样性研究多集中于乳制品和发酵产品，对植物表面自然附着乳酸菌的研究较少，本研究为进一步发掘青藏高原地区的乳酸菌资源具有积极意义.

［1］李勤志.我国马铃薯产业的经济分析［D］.武汉:华中农业大学，2005.

［2］孙立国.ICR 小鼠肠道乳酸菌的多样性分析及其组成与糖尿病关系的初步研究［D］.上海：上海交通大学，2008.

［3］吴春生，舒畅，李键，等.牦牛酸乳中乳酸菌的研究进展及前景展望［J］.食品工业，2012，33（9）:129-133.

［4］张国强，马长中，李亚辉，等.西藏发酵牦牛乳化学成分和微生物组成分析［J］.食品研究与开发，2011，32（6）:4-7.

［5］于洁，孙志宏，张家超，等.16SrDNA-RFLP 技术鉴定西藏地区乳制品中的乳杆菌［J］.食品与生物技术学报，2009，28（6）:804-810.

［6］Pang H，Tan Z，Qing G，et al.Phenotypic and phylogenetic analysis of lactic acid bacteria isolated from forage crops and grasses in the Tibetan Plateau ［J］.J Microbiol，2012，50(1):63-71.

［7］庞会利.饲料作物及发酵饲料中自然附着乳酸菌群的分类学研究［D］.郑州:郑州大学，2011.

［8］Saitou N，Nei M.The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees［J］.MolBiol Evol，1987，4:406-425.

［9］Eitan B D，Shapiro O H，Siboni N，et al.Advantage of using inosine at the 3' Termini of 16S rRNA gene universal primers for the study of microbial diversity［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72:6902-6906.

［10］Tohno，Kobayashi，Nomura，et al.Genotypic and phenotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from Italian ryegrass silage ［J］.J Anim Sci，2012，83:111-120.

［11］康蓉.甘肃马铃薯疮痂病病原鉴定及药剂防治［D］.兰州：甘肃农业大学，2013.

［12］秦彧，周志宇，姜文清，等.西藏主要栽培牧草、作物秸秆营养价值评价［J］.草业科学，2010，27（5）：140-147.