柠檬汁辅助雪梨汁催化转化原人参二醇组皂苷制备稀有人参皂苷Rg3

成乐琴，金富标

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

0 前言

人参皂苷是人参的有效活性成分，人参皂苷Rg3 作为次级人参皂苷，对肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤细胞均具有一定的抑制作用[1]，此外，人参皂苷Rg3还具有抗衰老、降压、增强身体免疫力等作用[2].目前，人参皂苷Rg3 的制备方法主要有酸水解法[3]、酶和微生物降解法[4]、半合成法[5]等，其中采用无机酸或有机酸试剂水解最为常见.自然界中有很多富含有机酸的天然物，例如具有清肺止咳功效的雪梨[6]主要含有苹果酸、酒石酸、柠檬酸以及少量乙酸、琥珀酸等.在前期研究柠檬[7-8]和葡萄[9]催化制备人参皂苷Rg3 的基础上，作者利用来源广泛、价格低廉、可以食用的雪梨为酸催化剂，以原人参二醇组皂苷为原料，在柠檬汁辅助下制备稀有人参皂苷Rg3，探索安全、绿色环保的制备人参皂苷Rg3 的方法，也为含有清肺止咳功效的雪梨成分的人参皂苷Rg3 产品应用于保健食品提供技术支持和产品支持.

1 原料与方法

1.1 原料和试剂

雪梨、柠檬由超市购买；人参根总皂苷：吉林抚松第一参厂；甲醇、正丁醇、氯仿、硫酸为分析纯；HPLC 检测中所用的甲醇、乙腈为色谱纯；蒸馏水为实验室去离子水；人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 标准品：成都曼斯特生物科技有限公司.

1.2 主要仪器与设备

高效液相色谱仪：大连依利特分析仪器有限公司；色谱柱Pinnacle ⅡC18：RESTEK U.S 的250 mm×4.6 mm，5 μm；RE-52C 旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 人参根总皂苷中原人参二醇组皂苷的分离提纯

按文献[10]的方法进行原人参二醇组皂苷（以下简称PPD 皂苷）的分离.

1.3.2 柠檬汁辅助雪梨汁制备人参皂苷Rg3 的方法

取若干2.0 mL 离心管，加入200 μL 质量浓度为10 mg·mL-1的PPD 水溶液，加入一定量的不同配比的柠檬汁和雪梨汁的混合液，在一定温度下反应数小时.反应产物加入碳酸钠水溶液调节pH=7，用等体积水饱和正丁醇反复萃取5 次，合并有机层，用旋转蒸发仪减压浓缩至干.残留物中加入2 mL 色谱纯甲醇，超声加速溶解，用0.45 μm 滤膜过滤，并通过HPLC 进行人参皂苷的定量分析.人参皂苷Rg3 的收率以其两种差向异构体20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的收率之和计算，具体计算公式如下：

式中，人参皂苷Rg3 的理论产量是原料PPD 皂苷中人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 等5 种皂苷100%转化生成人参皂苷Rg3 时的两种差向异构体20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的理论产量之和.

1.3.3 HPLC 分析方法

流速：1.0 mL·min-1；检测波长：203 nm；柱温：室温；进样量：20 μL；流动相A 为乙腈，B 为纯净水（超声除气处理）.梯度洗脱程序：0.00～10.00 min，A:22% ；10.00～20.00 min，A:22% ；20.00～25.00 min，A:27% ；25.00～45.00 min，A:31% ；45.00～60.00 min，A:38% ；60.00～65.00 min，A:52% ；65～75 min，A:52% ；75.00～75.10 min，A:55%；75.10～95.00 min，A:90%；95.00～95.10 min，A:90%；95.10～104.00 min，A:22%.

2 结果与讨论

2.1 原料中PPD 皂苷的分离及含量的测定

以人参根总皂苷为原料（其中原人参二醇组皂苷的含量为61.32%），按照文献[10]的方法，利用D101C 大孔吸附树脂静态吸附和解析，并结合溶剂沉淀法分离了PPD 皂苷.PPD 皂苷的HPLC 分析图见图1.

图1 分离提纯后PPD 皂苷的HPLC 分析图Fig.1 HPLC analysis of PPD saponins after separation and purification

对图1 中在保留时间37.85 min、39.43 min、41.70 min、42.39 min 和46.13 min 出现的PPD 皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 的吸收峰分别进行了定量（相应对照品的保留时间参见图2-A），结果表明5 种皂苷的总含量为92.78%，即纯度比分离提纯之前提高了51.3%.具体皂苷含量数据见表1.

2.2 单因素试验结果

2.2.1 柠檬汁与雪梨汁的配比对人参皂苷Rg3 收率的影响

在装有200 μL 质量浓度为10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 离心管中，分别加入200 μL雪梨汁和柠檬汁配比为100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40 的混合液，在90 ℃水浴锅中反应4 h.反应产物的HPLC 分析结果见表2.

表1 PPD皂苷中具体皂苷的定量分析结果Table 1 Quantitative analysis of specific ginsenoside in PPD saponins

由表2 可知，用100%雪梨汁催化反应时，人参皂苷Rg3 的收率较低，但加入少量柠檬汁时，Rg3 的收率显著提高，但继续加大柠檬汁比例，虽然PPD 皂苷中各种皂苷的转化率还在提高，但Rg3 的收率却反而下降，这是因为当柠檬酸比例过大时，溶液酸性过强，导致Rg3 进一步水解成Rg5等其他次级人参皂苷.考虑到柠檬汁主要是辅助雪梨汁，且其市场价格较高，因此选择雪梨汁与柠檬汁的配比为90∶10 进行进一步的优化.

表2 不同雪梨汁与柠檬汁配时人参皂苷Rg3 的HPLC 定量分析结果Table 2 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different snow pear juice and lemon juice ratio

2.2.2 PPD 皂苷与水果汁体积比对人参皂苷Rg3收率的影响

在装有200 μL 质量浓度为10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 离心管中，按照1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 体积比分别加入配比为90∶10 的雪梨汁和柠檬汁的混合液160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL，并在90 ℃水浴锅中反应4 h.反应产物的HPLC 分析结果见表3.

表3 不同PPD 皂苷与水果汁体积比时人参皂苷Rg3 的HPLC 定量分析结果Table 3 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different PPD saponins and fruit juice volume ratio

由表3 可见，随着果汁用量的增加，人参皂苷Rg3 的收率呈现先升后降的趋势，当PPD 与果汁体积比为1∶1.4 时，人参皂苷Rg3 的收率达到68.97%，而进一步增加体积比，Rg3 的收率和得率明显下降，说明PPD 与混合果汁体积比为1∶1.4时，反应效果最佳.

2.2.3 反应温度对人参皂苷Rg3 的收率影响

将装有200 μL 质量浓度为10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液与配比为90∶10 的雪梨汁与柠檬汁溶液以1∶1.4 混合均匀，分别在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃水浴锅中反应4 h.反应产物的HPLC分析结果见表4.

表4 不同反应温度下人参皂苷Rg3 的HPLC 定量分析结果Table 4 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction temperature

由表4 可见，随着反应温度从75 ℃到90 ℃不断升高，PPD 皂苷的转化率和人参皂苷Rg3 的收率均在逐渐提高，当反应温度进一步升高时，虽然PPD 皂苷的转化率仍在增加，但人参皂苷Rg3 的收率却没有增加，说明较高的反应温度会导致其他副反应的发生.由此可见，制备人参皂苷Rg3 的适宜反应温度为90 ℃.

2.2.4 反应时间对制备人参皂苷Rg3 收率的影响

将装有200 μL 质量浓度为10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液与配比为90∶10 雪梨汁与柠檬汁溶液以1∶1.4 混合均匀，在90 ℃水浴锅中分别反应3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h.反应产物的HPLC 分析结果见表5.

表5 不同反应时间人参皂苷Rg3 的HPLC 定量分析结果Table 5 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction time

由表5 可见，在3.0～4.5 h 范围内，随着反应时间的延长，除了Rb3 的转化率有所波动以外，其他PPD 皂苷的转化率及Rg3 的收率均显著增加，当反应时间为4.5 h 时，人参皂苷Rg3 的收率达到最高为76.00%（见图2），而继续延长反应时间，Rg3 的收率反而下降.这是因为随着反应时间的延长，PPD 皂苷原料逐渐枯竭，使PPD 皂苷转化生成Rg3 的速率低于生成的Rg3 进一步通过脱水生成Rg5、Rk1、Rz1 及通过水解生成其他副产品的速率.

图2 人参皂苷标准品(A)及反应时间为4.5 h 时PPD 皂苷转化产物(B)的HPLC 分析谱图Fig.2 HPLC analysis of ginsenoside standards(A) and transformation product(B) for PPD saponins in 4.5 h reaction time

3 结论

通过单因素试验优化了柠檬汁辅助雪梨汁催化水解PPD 皂苷制备稀有人参皂苷Rg3 的工艺条件.结果表明，人参皂苷Rg3 的最高收率为76.00%，与单独使用柠檬汁的收率相当[8]，说明混合果汁具有很强的酸催化效果及制备人参皂苷Rg3 的能力；同时通过柠檬汁辅助雪梨汁制备人参皂苷Rg3 时，柠檬汁的用量不足单独使用柠檬汁时其用量的1/6，不仅酸性更加温和，更容易控制反应，而且还能降低成本.

利用富含果酸的雪梨汁与柠檬汁混合液处理PPD 皂苷制备人参皂苷Rg3，与酸性化学试剂作酸催化剂相比，反应过程绿色无污染、操作简单，反应产物兼具人参成分和水果成分，可有效改善产品口感，为大量天然糖苷类化合物的水解制备药效更好的次级苷提供了新的途径.

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