极端低温处理对玉米象保护酶活性的影响

张会娜，吕建华，白旭光，刘淑丽

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

昆虫属于变温动物，温度几乎影响昆虫生长发育及生存的各个方面.温度可直接作用于昆虫酶活性并影响昆虫的行为与健康，是重要的环境因素之一[1].低温能导致昆虫体内氧负离子（O2-）、单线态氧（1O2）等活性氧自由基增加，造成细胞膜脂的过氧化损伤.低温胁迫下，昆虫能利用生理调整策略来适应环境，其中包括酶代谢水平的改变、防冻保护剂的合成等[2].超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能相互协调清除活性氧，起到防止自由基毒害的积极作用，被称为保护酶系统[3].SOD 能催化超氧阴离子自由基（O2·-）发 生 歧化反应生成H2O2和O2，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的重要保护酶.CAT 和POD 存在于过氧化物酶体中，具有分解H2O2的作用，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成有害的—OH，是生物抗氧化防御系统的关键酶[4].因此，极端低温条件下保护酶活性水平可作为衡量昆虫抗寒性强弱的重要指标.作者以重要储粮害虫玉米象Sitophilus zeamais 成虫为研究对象，探究极端低温条件下玉米象保护酶活性的变化，为揭示昆虫对低温的适应机制、有效进行低温杀虫、科学实施低温储粮提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试昆虫为河南工业大学储藏物昆虫实验室饲养数代的玉米象，在（28±1）℃、RH（75±5）% 的条件下以整粒干净的小麦饲养，取羽化后1～2 周的健康成虫供试.

1.2 低温处理方法

在洗净、烘干的玻璃瓶（直径4 cm，高9.5 cm）内部瓶口处涂上聚四氟乙烯（防止试虫逃逸），再烘干并冷却至室温，放入20 头羽化1～2 周的玉米象成虫（不分雌雄）.设置高低温试验箱温度分别为-8、-12、-16、-20 ℃4 个温度梯度，达到设定温度并稳定后快速放入装有试虫的玻璃瓶，处理一定的时间后快速取出，重复3 次，在液氮中研磨制备酶液.不同低温下不同处理时间设定见表1.

表1 玉米象成虫的处理温度和时间设置Table 1 Exposure time for S.zeamais adults at different treatment temperatures

1.3 酶活性测定

1.3.1 酶液的制备

参照李周直等[4]的方法并加以改进.取经过低温处理的玉米象成虫20 头，用pH 7.2 的Tris-HCl缓冲液（内含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）清洗干净，液氮研磨，将研磨液转入2.0 mL 预冷的离心管中，用Tris-HCl 缓冲液冲洗研钵后并入研磨液中，用缓冲液补充至2.0 mL，于0～4 ℃以11 000 r/min 离心20 min，取上清液作为提取酶液，储存于4 ℃冰箱中.

1.3.2 蛋白质的测定

参照Bradford[5]的标准曲线法测定上述酶液中蛋白质含量（mg/mL）.

1.3.3 酶活性测定

超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）活性的测定参考马志卿等[6]的邻苯三酚法.调整H2O、邻苯三酚的比例，保证邻苯三酚的自氧化速率为0.70，加入pH 为8.2 的0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和1% EDTA），SOD 活性计算公式为：

式中：OD1为邻苯三酚2 min 吸光度，OD2为样品所测吸光度；试虫蛋白质含量，mg.一个酶活单位(U)相当于4.525 mL 反应液达到50%的抑制所需的酶量，酶活性以U/mg 表示.

过氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性的测定参考Simon 等[7]的愈创木酚法.反应混合液为2.0 mL pH 为4.0 的醋酸缓冲液、50 μL 酶液、1.0 mL 0.05 mol/L 愈创木酚、1.0 mL 0.3 mol/L 的H2O2，加入试管立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm 波长下比色，以蒸馏水调零，以缓冲液代替酶液作对照，记录4 min 后的吸光度值.以每分钟吸光度改变1为一个酶活单位(U)，POD 活性计算公式为：

式中：OD1为混合液470 nm 的吸光度，t 为反应时间.

过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性的测定参考杨兰芳等[8]的标准曲线法.取A、B 两支试管，A为对照管，B 为样品管.在A 中按顺序加入1.5 mL pH 7.8 Tris-HCl 缓冲溶液（内含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）、0.1 mL 酶液、1.4 mL H2O、1.0 mL 8% H2SO4；B 管依次加入1.5 mL Tris-HCl缓冲溶液、0.1 mL 酶液、1.1 mL H2O、0.3 mL 0.3 mol/L 的H2O2，摇匀，反应3 min 后加入1.0 mL 8%H2SO4终止反应.用A 管调零，在波长为240 nm 处测定样品管的吸光度，酶活性计算公式为：

式中：A2为对照的吸光度，A1为样品的吸光度，t 为反应时间（min），a、b 为标准曲线回归方程中的常数.

1.4 数据处理与分析

对所取得的数据采用Microsoft Excel 2010、SAS 9.0 软件进行方差分析，采用Duncan′s 新复极差法进行多重比较，检验试验结果的可信度以及不同处理结果的差异显著性.

2 结果与分析

2.1 吸光度与蛋白质、过氧化氢含量的关系

对不同含量的蛋白质、过氧化氢所对应的吸光度进行相关性分析，结果如图1、图2 所示.由图1、图2 可知，蛋白质和H2O2含量都与吸光度呈显著的线性关系，相关系数均达到0.997 9，因此，利用标准曲线法进行蛋白质和H2O2定量分析是可行的.

图1 吸光度与蛋白质含量关系的标准曲线Fig.1 Standard curve of absorbance value and protein content

图2 吸光度与H2O2 含量关系的标准曲线Fig.2 Standard curve of absorbance value and H2O2 content

2.2 低温对玉米象成虫保护酶活性的影响

2.2.1 -8 ℃低温处理对玉米象保护酶活性的影响

玉米象成虫经-8 ℃低温处理不同时间后其SOD 活性整体呈现先升高后降低再升高的趋势，POD 和CAT 活性则随着处理时间的延长先升高后降低（表2）.短时低温处理对试虫酶活性起到激活作用.由表2 可知，在低温处理时间为60 min 时，3 种保护酶活性都出现最大值，显著高于对照组水平（P＜0.05），之后则呈现下降趋势，酶活性受到抑制.SOD 在处理时间为180 min 时活性达到最低值6.32 U/mg，为对照组的85.9%，表现为抑制作用.POD 和CAT 在处理时间为480 min 时活性最低，与最大值相比，降幅分别为38.5%和59.1%，延长低温处理时间能抑制保护酶的活性.

2.2.2 -12 ℃低温处理对玉米象保护酶活性的影响（表3）

从表3 可以看出，在-12 ℃低温处理条件下，随着处理时间延长，试虫体内SOD、POD、CAT 活性都是先升高后降低.在处理时间为40～110 min 之间，SOD 活性降幅达到51.6%，活性被逐渐抑制，经方差分析，不同处理时间活性差异达到显著水平（F=11.503，df=8，P=0.000）.POD 活性在低温处理时间为110 min 时显著低于对照组，其他低温处理时间活性水平则跟对照组无显著性差异（P ＞0.05），表明低温处理时间延长到一定程度时对POD 的抑制作用较明显.CAT 在低温处理时间为60、70 min 时活性高于对照组，分别是对照组的1.64 和1.66 倍，活性被激活，其他时间段活性与对照组无显著性差异（P＞0.05）.

表2 -8 ℃低温处理不同时间后玉米象体内保护酶活性变化Table 2 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -8 ℃low temperature

表3 -12 ℃低温处理不同时间后玉米象体内保护酶活性变化Table 3 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -12 ℃low temperature

2.2.3 -16 ℃低温处理对玉米象保护酶活性的影响

经-16 ℃低温处理不同时间后，玉米象体内3种保护酶活性变化趋势与-12 ℃处理类似，3 种保护酶活性出现先升高后降低的现象（表4）.低温处理时间由25 min 延长到60 min 时，SOD 活性由13.18 U/mg 逐渐降低至7.24 U/mg，活性被抑制.POD 和CAT 活性在处理时间为40 min 时达到峰值，显著高于对照组（P＜0.05）.整个处理过程中，POD 和CAT 活性整体较高，在低温处理时间达到60 min 时活性出现最低值.

2.2.4 -20 ℃低温处理对玉米象保护酶活性的影响（表5）

由表5 可知，在-20 ℃低温处理时玉米象成虫SOD 活性变化趋势与-12 ℃、-16 ℃处理时相同，都是随着处理时间的延长先升高后降低.POD、CAT 活性随着处理时间延长逐渐降低，活性被抑制.3 种保护酶峰值都出现在处理13 min 时，当低温处理时间延长到30 min 时，与最大值相比，SOD、POD、CAT 活性分别降低了8.46 U/mg、0.11 U/mg、2.69 mg/（mg·min），差异达到显著水平（P＜0.05），表明延长低温处理时间能导致保护酶代谢水平减弱.

表4 -16 ℃低温处理不同时间后玉米象体内保护酶活性变化Table 4 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -16 ℃low temperature

3 结论

昆虫体内酶代谢水平与环境温度密切相关.本文研究结果表明，玉米象体内的保护酶代谢水平受温度和处理时间的影响，温度越低，酶活性下降越快.在-8 ℃低温下处理玉米象480 min 后，其SOD 活性仍高于对照水平，表明亚致死低温胁迫能导致SOD 活性提高，使自由基的清除能力增强，POD 和CAT 活性则低于对照组，表明活性受抑制，可能影响3 种酶的协调作用.短时间的极端低温处理后，保护酶活性出现应激性升高现象，对试虫免受自由基损伤和增强耐低温性起重要作用，但保护酶的调节作用有限，持续延长低温处理时间能导致保护酶代谢水平下降，影响昆虫正常的生理功能[9-10].

表5 -20 ℃低温处理不同时间后玉米象体内保护酶活性变化Table 5 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -20 ℃low temperature

SOD 催化O2·-发生歧化反应（O2·-+O2·-+2H+→O2+H2O2）是昆虫低温抗氧化防御系统的主要过程，在防止蛋白质、膜脂等细胞的过氧化损伤方面起重要作用[11-12].本文研究结果表明，在不同程度的低温处理下，玉米象体内SOD 活性在低温处理初期较高，表明昆虫在受到低温胁迫时，体内活性氧自由基能在短时间内增加，导致SOD 催化超氧阴离子自由基能力变强，相应增强昆虫的耐低温能力.但由于SOD 显示出不同的特性和细胞间的定位，不能排除在极端低温条件下一些SOD 同工酶活性是不断变化的[13].CAT 能将H2O2转化为H2O 和O2，POD 则通过酚类化合物和抗氧化剂共基质的氧化分解H2O2，与CAT 共同作用清除H2O2[14].在本研究中，玉米象体内POD 和CAT 活性一般在低温处理中期达到峰值，相对SOD 有一定的滞后效应，可能是由于CAT 对H2O2亲和力较低，或者因为CAT 是局部的过氧化物酶体，在H2O2浓度低于一定阈值时不催化反应[15].由此表明玉米象体内3 种保护酶在抵御极端低温胁迫方面具有协同作用.昆虫在受到低温胁迫时，体内产生的氧自由基增加，抗氧化体系能迅速启动体内防御系统，使SOD 催化O2·-歧化反应生成H2O2，H2O2浓度上升引起POD 和CAT 活性的增强，随着处理时间的延长，3 种保护酶活性降低，可能导致细胞受到氧化损伤.

极端低温能改变昆虫体内保护酶的代谢水平，其变化情况受低温程度和低温持续时间的影响.值得注意的是，仅对保护酶活性变化进行分析并不能完全解释昆虫抗氧化机理，在极端低温胁迫下昆虫的保护机制是一个非常复杂的过程，包括一些抗氧化分子的产生和其他酶类的变化，它们对昆虫的生理生化调控作用机制还有待进一步研究[16-17].

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