OBHS对C6神经胶质瘤细胞H2O2损伤的保护作用

邓丽娟，骆淑媛

（武汉东湖学院 生命科学与化学学院，湖北 武汉430212）

1 引言

阿尔茨海默病（AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性疾病，有研究表明氧化应激参与了AD的发生，但其具体的发病机制仍不十分清楚。目前，雌激素替代疗法广泛用于AD的预防与临床治疗，但是长期使用雌激素会增加患者罹患中风、心血管疾病以及乳腺癌和宫颈癌的危险，因此限制了雌激素的临床应用［1，2］。选择性雌激素受体调节剂（SERMs）是一类具有类雌激素激动或拮抗作用的人工合成化合物，可以直接代替雌激素发挥作用，而副作用远小于雌激素。因此本研究以H2O2损伤的神经胶质瘤母瘤细胞C6为模型，探讨了OBHS对神经胶质瘤细胞H2O2损伤的保护作用，为AD药物防治研究提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 主要试剂与仪器

DMEM培养基和胎牛血清均购于Hyclone公司，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I购于BD Biosciences公司，Bcl-2抗体购于Santa Cruz公司。

2.2 方法

2.2.1 H2O2损伤模型建立

收集处于对数生长期的C6细胞，调整细胞密度为105个细胞/mL，接种于96孔培养板，37℃，5%CO2环境下培养24h后，设置对照组和浓度处理组，H2O2终浓度分别为0、100、150、200、250、300μmol/L，每组4个重复孔。培养24h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，37℃继续孵育4h后，吸去孔内培养上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡10min。在酶标仪上以OD570为测定波长，OD630为参考波长，测定吸光值。空白对照组MTT代谢率设为100%，重复3次，建立氧化损伤模型。

2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

各处理组收集细胞，PBS洗涤2次，bingding buffer重新悬浮细胞至1×106个细胞/L，取100μL上述溶液，加5μL FITC Annexin Ⅴ和5μL PI，室温避光静置15min后，加400μL bingding buffer，过滤后1h内进行流式细胞分析，测定坏死、凋亡和正常细胞的百分率。

2.2.3 Western－blot检测

收集细胞，PBS洗涤2次，加上样缓冲液重悬细胞，100℃煮沸10min，13 000r/min，离心10min，取上清。以10%分离胶进行SDS-PAGE，半干电转至NC膜，室温封闭1h，加一抗4℃过夜，二抗室温反应1h，显影。

2.3 统计学方法

应用Origin 8.0软件分析处理数据，使用Turkey检验及One-way ANOVA方差检验来判断实验结果是否具有差异。p＜0.05时认为是差异显著，具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 H2O2损伤模型的建立

采用不同浓度的H2O2处理C6细胞后，MTT检测细胞活性，实验结果表明：随着H2O2浓度的增加，细胞活力逐渐下降，具有浓度依耐性，当 H2O2浓度达到250μmol/L时，细胞活力只有60.9%±2.93%（p＜0.01），达到预期损伤值（图1）。

不同浓度的H2O2作用C6细胞24h后，MTT检测细胞存活率。所示数据为mean±SD，n=4；＊＊P＜0.01，vs空白对照组。

3.2 OBHS抵抗H2O2毒性作用

采用流式细胞术检测1μmol/LOBHS预处理24h对H2O2损伤C6细胞的影响，实验结果表明：在H2O2处理组中，细胞存活率为60.04%，而在OBHS预处理组中，细胞存活率上升至82.34%（图2-B），说明OBHS具有对抗由H2O2所诱导的C6细胞损伤的能力。

（A）OBHS结构式；（B）OBHS（1μmol/L）预处理C6细胞24h后，加入 H2O2（250μmol/L）作用24h，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。R2区为坏死细胞，R3区为晚期凋亡细胞，R4区为正常细胞，R5区为早期凋亡细胞。

3.3 OBHS影响抑凋亡蛋白Bcl－2的表达

在C6细胞中，H2O2作用24h后，细胞内Bcl-2蛋白质的表达量会有显著下降，而用OBHS预处理24h后可以回复H2O2引起的Bcl-2下调作用（图3）。

OBHS（1μmol/L）预处理 C6细胞24h后，H2O2（250μmol/L）作用24h，western-blot检测Bcl-2蛋白质表达水平。所示数据为 mean±SD，n=3；＊P＜0.05，vs空白对照组；＃P＜0.05，vs H2O2实验组。

4 讨论

有许多研究表明，氧化压力是很多人类疾病包括神经退行性疾病的细胞损伤的主要原因。活性氧类物质（双氧水、超氧化物阴离子等）易于损伤细胞内的生物大分子，最终导致细胞凋亡或坏死。因此，通过抗氧化物来消除过多的活性氧类物质或是抑制它们的产生，可能是阻止氧化压力造成细胞损伤的有效方法。

OBHS是人工合成的一种选择性雌激素受体调节剂［3］，有较强的抗炎 症功能［4，5］，具有 广 泛的 应用 前 景。而有研究表明具有酚羟基结构的物质通常有一定的抗氧化的功能［6］，OBHS作为一种人工合成的SERMs，含有两个酚羟基结构（图2-A），因此我们推测OBHS可能也具有抗氧化的能力。而实验结果显示，OBHS能抑制H2O2引起的细胞损伤，并回复细胞内抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。因此，我们推测可能是OBHS具有抗氧化能力，消除了H2O2产生的氧化压力，从而恢复了细胞内Bcl-2基因的正常表达，抑制了细胞凋亡，达到神经保护的效果。

综上所述，本研究通过加入H2O2建立氧化损伤模型，检测到新型选择性雌激素受体调节剂OBHS具有强的抗氧化能力，能减缓H2O2所诱导的细胞损伤，具有神经保护作用。

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