杜仲叶中总黄酮的超声波提取工艺优化

2015-04-23罗飞华杜惠蓉

绿色科技 2015年11期

罗飞华，杨莉，张萍，杜惠蓉

（1.四川文理学院化学化工学院，四川达州635000；2.“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室，四川达州635000）

1 引言

杜仲（EucommiaulmoidesOliver）是中国名贵滋补药材，主要分布在秦岭以南的山地［1，2］。《神农本草经》记载杜仲具补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效，其药用历史悠久，在临床医学领域有着广泛的应用［3，4］。中国药典规定其树皮作为中药杜仲入药，随着需求量的日益增加，杜仲皮资源紧张。近来研究表明杜仲叶不仅与皮含有相似的有效成分，而且药理作用也相同［5～8］。因此研究和开发杜仲叶资源在传统中药材保护及可持续发展方面具有重要的现实意义。本文采用超声波提取法对杜仲叶中的黄酮类物质进行提取，通过单因素试验和正交实验，研究杜仲叶中总黄酮的最佳提取工艺，为杜仲叶中有效成分的提取提供理论基础。

2 材料与仪器

2.1 主要仪器

UV-2500型紫外可见分光光度计（日本岛津）；KH-3200B型超声清洗仪（昆山禾创）；HK-02A型手提中草药粉碎机（广州旭朗）；FA1004型电子分析天平（上海花潮）；5418小型高速离心机（德国艾本德）；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海齐欣）；8目的筛子。

2.2 主要试剂

新鲜杜仲叶（采摘于四川万源）、芦丁标准品（购于国家标准物质信息中心）、无水乙醇（AR）、亚硝酸钠（AR）、硝酸铝（AR）、氢氧化钠（AR）等；二次蒸馏水。

3 实验过程

3.1 芦丁标准曲线的绘制

用天平精确称取芦丁标准品41.8mg置于25mL的小烧杯，在搅拌状态下分多次加入总体积约为15mL的50%乙醇溶液直至完全溶解，并转入100mL的容量瓶中定容，即得芦丁标准品储备液（41.8mg/mL）。分别移取配制好的储备液0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.00mL、2.50mL于6个10mL容量瓶中，各加入50%乙醇溶液至容量瓶体积的一半，加入质量分数为5%的NaNO2溶液1.0mL，混合摇匀后放置8min，加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液1.0mL，摇匀放置8min，加入1mol/L的氢氧化钠溶液5mL，混匀后用50%的乙醇定容，摇匀后放置15min。以空白瓶作为对照，在最大吸收波长处依次测定各浓度芦丁标准品的吸光度。

3.2 样品中总黄酮的提取及含量测定

新采摘的杜仲原叶经水洗自然晾干后于180℃下杀青3min，于80～90℃烘干，粉碎后过8目筛，得杜仲原叶粉末于4℃保存备用。精确称取杜仲叶粉末1.0g，加入适量50%乙醇进行超声提取，将提取液离心，取上层清液于25mL容量瓶中。残渣重复进行超声提取、离心、收集上层清液，最后用50%乙醇定容即为杜仲原叶提取液。精确移取提取液5mL于25mL的容量瓶中，按3.1节所述方法进行处理并测定其吸光度，根据回归方程计算提取液浓度，并按下式计算总黄酮提取率［9～11］。

其中：C为由标准曲线方程计算所得提取液中总黄酮浓度（g/L）；M为称取杜仲叶粉末的质量（g）。

3.3 杜仲叶总黄酮提取单因素实验

按照3.2中的实验方法，分别考察不同提取料液比、乙醇浓度、超声时间和提取次数对总黄酮提取效率的影响，得出最佳提取工艺的单因素条件［9，12，13］。

3.4 杜仲叶总黄酮提取正交实验

在已有的单因素实验结果基础之上，选取其中3个因素进行正交实验。选取的三因素分别为乙醇体积分数（A）、料液比（B）和超声时间（C）。以总黄酮提取率为指标，进行正交实验（表1）。

表1 正交试验因素水平

4 结果与讨论

4.1 芦丁波长扫描

将芦丁标准品储备液在400～800nm波长范围内进行扫描，芦丁在510nm处吸光度最强，故选择510 nm为检测总黄酮含量的波长，如图1所示。

4.2 芦丁标准工作曲线

按照3.1节中的方法在510nm最大吸收波长处测定标准品溶液吸光度，以芦丁标准液浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标画出浓度与吸光度之间的标准曲线，如图2所示，标准工作曲线方程为y=0.012x-0.0011，R2=0.9996。

4.3 单因素试验优化总黄酮提取条件

4.3.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

精确称取杜仲叶粉末6份各1.0g，分别加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各10mL，在超声功率为900W和40℃的条件下超声浸提20min。研究乙醇浓度对杜仲叶中总黄酮提取的影响，结果见图3。

乙醇浓度在30%～50%之间，总黄酮的提取率随乙醇浓度增大而上升，并在50%时达到最大值9.47%，之后随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率反而下降。这可能是由于乙醇浓度的增加使得混合溶剂的极性下降，溶剂与黄酮类物质极性的相似程度降低，从而导致不利于黄酮类物质的溶出。因此选择体积分数为50%的乙醇水溶液作为后续实验的溶剂浓度。

4.3.2 液料比对总黄酮提取率的影响

精确称取杜仲叶粉末5份各1.0g，选取料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16g/mL，乙醇浓度为50%，在超声功率为900W和40℃条件下分别提取20min。研究不同料液比对杜仲叶中总黄酮提取的影响，结果见图4。

实验结果表明，液料比在1∶8～1∶14g/mL间总黄酮的提取率基本呈现一个缓慢的上升趋势。当料液大于1∶14g/mL以后，总黄酮的提取率呈明显下降趋势，最大提取率为8.5%。因此选择料液比1∶14g/mL为后续实验的料液比。

4.3.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

精确称取杜仲叶粉末6份各1.0g，在乙醇浓度为50%，液料比为1∶14g/mL，超声功率为900W和40℃条件下分别超声5、10、15、20、25、30min。研究不同超声时间对杜仲叶总黄酮提取的影响，结果见图5。

随着超声时间的延长，总黄酮提取率开始呈现出不断增大的趋势，并在提取时间增加到20min时总黄酮提取率达到最大值8.70%。20min以后随着超声时间的继续增加，总黄酮的提取率开始缓慢减小。这可能是由于超声时间过长，部分黄酮类物质会被氧化或分解，反而影响提取效率。

4.3.4 提取次数对总黄酮提取率的影响

精确称取杜仲叶粉末5份各1.0g，在乙醇浓度为50%，液料比1∶14g/mL，超声功率为900W，温度为40℃和超声时间为20min条件下分别超声提取1、2、3、4、5次。研究提取次数对杜仲叶总黄酮提取的影响，结果见图6。

由图可见随着超声提取次数的增加，杜仲叶中总黄酮的提取率总体上呈现出增加的趋势，从第1次到第3次提取总黄酮提取率增加了6.4%，而经过了3次提取以后总黄酮的提取率增加变得平缓，这说明3次提取以后重复提取的效率开始明显变低。因此综合考虑提取成本和效率的问题提取次数选择3次比较合适。

4.4 正交试验优化总黄酮提取条件

根据单因素实验的结论，按照表1中所设计的方法进行三因素正交实验，结果见表2。

表2 正交试验结果

从表2结果分析可见，在我们所选取的3个因素中影响总黄酮提取率的主次顺序为A＞C＞B，即液料比＞乙醇浓度＞提取时间，故料液比是影响本工艺对杜仲叶中黄酮提取的主要因素。因此，通过以上实验得出本工艺对杜仲叶总黄酮提取的最佳条件为：乙醇浓度50%，液料比1∶14g/mL，超声时间20min，且提取次数为3次。