蛇葡萄素钠联合卡铂对人肺腺癌GLC-82细胞增殖及凋亡的影响

王　霞，韩　伟，葛　斌，吴勇杰

(1.兰州大学基础医学院药理学研究所，甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州　730000; 2.甘肃省人民医院，甘肃兰州　730000;3.甘肃中医学院定西校区，甘肃定西　743000)



蛇葡萄素钠联合卡铂对人肺腺癌GLC-82细胞增殖及凋亡的影响

王霞1，2，韩伟3，葛斌2，吴勇杰1

(1.兰州大学基础医学院药理学研究所，甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州730000; 2.甘肃省人民医院，甘肃兰州730000;3.甘肃中医学院定西校区，甘肃定西743000)

摘要:目的探讨蛇葡萄素钠(AMP-Na)单用及其与卡铂(CBP)合用对人肺腺癌GLC-82细胞增殖的抑制作用及可能的机制。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定两药单用及合用对GLC-82细胞的体外杀伤活性;透射电子显微镜(TEM)观察GLC-82细胞超微结构的变化;流式细胞仪(FCM)检测GLC-82细胞凋亡和caspase-3的表达。结果对于GLC-82细胞，AMP-Na与CBP合用，CBP的IC(50)由(17.10±4.78) mg·L(－1)降低到＜3.12 mg·L(－1)(P＜0.01)，表明Amp-Na对卡铂抑制GLC-82细胞增殖的作用具有协同效应(CDI＜1)。TEM及FCM检测结果表明，单用AMP-Na及与卡铂合用均可诱导GLC-82细胞凋亡、坏死，两药合用后坏死率由(2.56±0.41) %升高到(71.83± 5.43) % (P＜0.01)。AMP-Na单用及与卡铂合用作用于GLC-82细胞48 h后，caspase-3的表达均明显增高。结论AMP-Na和CBP具有协同诱导GLC-82细胞凋亡的作用，机制可能与激活细胞内caspase-3介导的信号转导通路相关。

关键词:蛇葡萄素钠;卡铂;人肺腺癌GLC-82细胞;细胞凋亡;细胞坏死; caspase-3

蛇葡萄素(ampelopsin)是存在于葡萄科植物中的一类重要的黄酮类化合物。近年来的研究发现，蛇葡萄素具有体内外抗肿瘤、消炎镇痛、祛痰止咳、保肝护肝等作用［1－2］。蛇葡萄素钠(ampelopsin sodium，AMP-Na)是本实验室为了提高蛇葡萄素的溶解性及稳定性，使其成为更适合临床使用的药物剂型而制备的高水溶性钠盐。AMP-Na联合卡铂(CBP)后对肿瘤细胞的作用是否有改变，目前尚不确定，所以在前期实验的基础上，采用MTT法研究AMP-Na与CBP合用对人肺腺癌GLC-82细胞的细胞毒作用，应用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响，初步探讨AMP-Na与CBP合用对GLC-82细胞增殖的抑制作用及机制。

1　材料与方法

1.1药品与试剂蛇葡萄素钠(AMP-Na)冻干剂:每支50 mg，批号:051115，纯度98.8 %; AMP-Na冻干剂专用稀释液(0.1 mol·L－1，pH=6.8磷酸盐缓冲液:每支5 mL，批号051118)，均由广东泰禾医药科技有限公司提供。卡铂:江苏齐鲁制药有限公司产品，批号:5090061 DA。新生小牛血清:杭州四季青生物工程有限公司产品，批号: 050126。RPMI 1640培养基: Gibco Invitrogen Corporation，USA产品。MTT: Fluka公司产品，用pH=7.4的PBS配制成5 g·L－1，过滤除菌分装，4℃保存(2周内有效)。

1.2细胞系人肺腺癌GLC-82细胞，购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。

1.3仪器CO2培养箱: Shellab 2306、Shellab 2323均为USA产品。超净工作台: SW-CJ-IFD苏州净化设备有限公司产品。ELX800型酶联免疫检测仪: USA产品。流式细胞仪: Coulter Epics XL型，Beckman-Coulter Inc，Fullerton，CA，USA产品。倒置显微镜: OLYMPUS产品。透射电子显微镜: JEN-100CX日本电子公司产品。高速离心机: Anke TDl-5上海安亭科学仪器厂产品。

1.4MTT比色法测定AMP-Na单用及与CBP合用对人肺腺癌GLC-82细胞增殖的抑制作用取对数生长期(传代后24～48 h)的GLC-82细胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化、离心(1 000 r·min－1，5 min)，弃上清液，保留细胞沉淀，在细胞沉淀中加RPMI 1640培养液调整各细胞浓度至5×107·L－1，在96孔培养板中以每孔90 μL加入细胞悬液，培养24 h，待细胞贴壁后每孔加入药物10 μL，继续培养48 h。于实验终止前4 h每孔加入MTT 10 μL，实验终止时每孔加入10 % SDS 100 μL，置37℃、5% CO2的培养箱中过夜，次日先震荡10 min，然后于波长570 nm处测定吸光值。根据下式计算抑制率和药物相互作用指数(CDI)，并计算IC50值。

本实验数据中阴性OD值为减去空白对照的值，受试药OD均值为减去颜色对照的值。药物相为两药联合用药组与对照组570 nm吸光值的比值，A或B是各药单独用药组与对照组570 nm吸光值的比值。当CDI＜1时，两药有协同作用;当CDI＜0.7时，协同作用非常显著; CDI=1，则两药作用性质为相加; CDI＞1时，则两药作用性质为拮抗)。本实验整体分为5组，具体实验设计如下:阴性对照组: RPMI 1640完全培养液+细胞+溶媒(pH=6.8 PBS) ;阳性对照组: RPMI 1640完全培养液+细胞+ CBP;空白对照组: RPMI 1640完全培养液+溶媒;受试药组: RPMI 1640完全培养液+细胞+ AMP-Na系列浓度; RPMI 1640完全培养液+细胞+50 mg·L－1的AMP-Na+ CBP系列浓度; AMP-Na颜色对照组: RPMI 1640完全培养液+50 mg·L－1的AMP-Na。每个组的每个浓度设3个复孔，以3个复孔OD值的均数作为一次实验的数据。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡和caspase-3的表达

取对数生长期的GLC-82细胞，用含10 %小牛血清的RPMI 1640完全培养液调节细胞浓度1×108·L－1，以每瓶9 mL接种100 mL容量的6个培养瓶内，分别作为阴性对照组、卡铂对照(25 mg·L－1)组、AMP-Na (50 mg·L－1)单用组、AMP-Na (100 mg·L－1)单用组、AMP-Na (50 mg·L－1)+卡铂(25 mg·L－1)组、AMP-Na (100 mg·L－1)+卡铂(25 mg·L－1)组。培养24 h待细胞贴壁后，分别以每瓶1 mL加入药物或生理盐水，继续培养48 h。实验终止时，先将培养液离心(室温，1 000 r·min－1，5 min)弃上清，保留细胞沉淀;再用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，在显微镜下观察当细胞间隙增大、胞质回缩、胞核变圆(约2～3 min)后，加含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液中止消化，用吸管吹打均匀后将含细胞的培养液离心(1 000 r·min－1，5 min)，混合所得细胞沉淀，制备样本，用Multicycle软件分析，计算凋亡细胞百分数和各细胞周期百分数及caspase-3的表达;用FACScan进行流式细胞术检测分析。

2　结果

2.1细胞增殖抑制试验实验结果表明，AMP-Na 对GLC-82细胞的增殖具有明显的抑制作用，有浓度依赖性。AMP-Na 50 mg·L－1与卡铂系列浓度合用后，对GLC-82细胞的抑制率较两者单用时均增高，表明AMP-Na可以协同卡铂抗GLC-82细胞的增殖。见Tab 1。

Tab 1 Inhibition effects and IC50of AMP-Na or combinedwith carboplatin on GLC-82 cells(±s，n=9)

Tab 1 Inhibition effects and IC50of AMP-Na or combinedwith carboplatin on GLC-82 cells(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs negative group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs AMPNa;#P＜0.05，##P＜0.01 vs carboplatin

Negative control　0 Carboplatin　3.12　1.5±13.28 Carboplatin　6.25　7.9±7.99 Carboplatin　12.5　30.5±4.16＊＊Carboplatin　25　80.4±2.80＊＊Carboplatin　50　88.6±5.06＊＊AMP-Na　25　－13.0±9.37 AMP-Na　50　47.0±17.41＊＊AMP-Na　100　75.2±3.92＊＊AMP-Na　200　81.0±2.89＊＊AMP-Na+ CBP　50+3.12　63.5±11.37＊＊##AMP-Na+ CBP　50+6.25　69.7±0.11＊＊#AMP-Na+ CBP　50+12.5　67.7±18.45＊＊△##AMP-Na+ CBP　50+25　84.6±1.44＊＊△△##AMP-Na+ CBP　50+50　91.7±3.31＊＊△△#IC50of AMP-Na　57.39±17.35 IC50of CBP　17.10±4.78 IC50of AMP-Na+ CBP＜3.12

2.2Annexin V/PI双染法检测凋亡Annexin-VFITC/PI双标检测显示，药物作用48 h后，阴性对照组活细胞、凋亡细胞、坏死细胞占总细胞的百分比分别为(98.3±0.45) %、(0.53±0.13) %和(0.39± 0.34) %。卡铂25 mg·L－1处理组活细胞明显减少，凋亡细胞明显增多。100 mg·L－1的AMP-Na单用组及与卡铂合用组，几乎没有活细胞，大部分细胞处于坏死状态，尚有部分处于凋亡状态(Tab 2、Fig 1)。

实验结果表明，100 mg·L－1的AMP-Na作用于GLC-82细胞48 h后，大部分细胞处于凋亡和坏死状态。由于100 mg·L－1的AMP-Na单独使用时就产生了强大的细胞毒作用，所以其与卡铂合用后对GLC-82细胞的作用与卡铂单用比较，无明显变化(P＞0.05)。

2.3AMP-Na单用及与卡铂合用对GLC-82细胞caspase-3表达的影响卡铂25 mg·L－1、AMP-Na 100 mg·L－1处理GLC-82细胞48 h后，caspase-3的表达均明显增高，与阴性对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)。AMP-Na 100 mg·L－1与卡铂25 mg· L－1联合用药组细胞，caspase-3的表达明显增高，与阴性对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)，与卡铂25 mg ·L－1比较，无明显变化(P＞0.05)。见Tab 3、Fig 2。

Fig 1 Apoptotic rate of GLC-82 cells in different groups

Tab 2 Apoptosis and necrosis ratio of GLC-82 cells induced by AMP-Na or combined 48 h with carboplatin (珋±s，n=3)

Tab 2 Apoptosis and necrosis ratio of GLC-82 cells induced by AMP-Na or combined 48 h with carboplatin (珋±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs carboplatin group

Apoptotic cells　0.53±0.13　85.83±6.39＊＊#　26.53±14.61* ##　27.33±5.67＊＊##Necrotic cells　0.39±0.34　2.56±0.41＊＊#　72.87±14.34＊＊##　71.83±5.43＊＊##

Tab 3 Expression of caspase-3 induced by AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells±s，n=3)

Tab 3 Expression of caspase-3 induced by AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs negative group

Caspase-3　Control　CBP(25 mg·L－1)　AMP-Na(100 mg·L－1)AMP-Na+ CBP Positive rate/%　57.87±5.30　97.70±0.95＊＊　80.00±3.82＊＊　97.43±2.97＊＊MFI　2.32±0.13　3.97±0.40＊＊　3.03±0.13＊＊　4.81±0.98＊＊

Fig 2 The expression of caspase-3 in different groups

2.4透射电镜观察细胞形态的变化阴性对照组GLC-82细胞胞膜完整，微绒毛丰富，胞质中细胞器丰富，核膜清晰完整，染色质均匀分布(Fig 3A) ;卡铂处理组细胞胞膜完整，微绒毛减少，核膜清晰，线粒体扩张，胞质中出现大量空泡(Fig 3B) ; AMP-Na单用组，细胞表面光滑，微绒毛消失，细胞核固缩，核质比例增大，染色质凝集为团块状，分布与核膜边缘呈月牙状，细胞内出现大量空泡，线粒体肿胀(Fig 3C) ; AMP-Na与卡铂联用组，细胞膜表面的微绒毛明显减少，线粒体明显肿胀，染色质凝集并边集于核膜(Fig 3D)。

3　讨论

近年来肺癌已成为恶性肿瘤患者死亡的主要疾病，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌发病率的80%左右，预后较差，而化疗是晚期NSCLC的主要治疗方法，以铂类药物为基础的联合化疗虽能改善晚期NSCLC患者的生存期、症状和生活质量，但其疗效已经达到了平台期［3］，提高疗效关键在于推出高效低毒的新药。目前对于NSCLC的治疗，主张应用联合化疗，含铂方案目前是治疗晚期NSCLC的标准方案。但含铂方案有抗瘤谱窄、易产生耐药性等缺点，主要不良反应有骨髓抑制、消化道反应、脱发、肾毒性、肝毒性、神经毒性等［4－5］。由于以上原因，使得卡铂在临床上的使用受到限制。据国外报道，在临床上与卡铂协同用药可使预后差的许多肿瘤得到有效治疗［6－7］。所以找到一种与卡铂等化疗药物具有协同作用且低毒的药物，在提高其疗效的作用下，同时能大大降低其用药剂量，以克服其在临床使用中的不良反应、提高患者疗效是非常有意义的。本实验结果表明，50 mg·L－1的AMP-Na单用，对GLC-82细胞的IR为(53.6±11.07) %。卡铂3.12～12.5 mg·L－1单用的IC50为(17.10±4.78) mg ·L－1。AMP-Na 50 mg·L－1与卡铂3.12～12.5 mg ·L－1合用时，卡铂对GLC-82细胞的IC50＜3.12 mg ·L－1。表明50 mg·L－1的AMP-Na对卡铂抑制GLC-82细胞增殖的作用具有协同效应，且主要对低、中浓度的卡铂协同作用较强。

Fig 3 Ultrastructure change of apoptotic GLC-82 cells with transmission electron microscope (48 h，×10 000)

随着科学研究的深入，人们发现凋亡在肿瘤的发生、发展上也起着重要作用。目前的抗肿瘤药物作用主要有直接杀死或抑制肿瘤细胞生长，以及诱导肿瘤细胞凋亡两个方面。而是否能引起肿瘤细胞凋亡又是评价化疗药物优劣的重要指标。本实验通过透射电镜观察可见，AMP-Na处理组及与卡铂联用组出现典型的凋亡相关的形态学变化，这说明AMP-Na可诱导GLC-82细胞凋亡，是其抗肿瘤作用机制之一。细胞凋亡的发生是一个极其复杂的过程，受多种机制调节和制约。凋亡发生机制中最关键的环节之一是caspase的激活，而caspase-3是目前已知与凋亡关系最密切的caspase家族成员之一。本实验结果表明，AMP-Na可以活化细胞内的caspase-3，而活化的caspase-3能裂解DNA修复相关分子、凋亡抑制蛋白、细胞外基质蛋白及骨架蛋白等，促使细胞凋亡。此外，由于caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度［9］。所以本实验结果提示，AMPNa诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一可能是通过激活细胞内的caspase-3介导的信号转导通路，从而促进凋亡的发生。总之，细胞凋亡的发生是一个极其复杂的过程，有关AMP-Na诱导肿瘤细胞凋亡的机制还有待进一步研究。

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Effect of ampelopsin sodium combined with carboplatin on the proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma cell GLC-82

WANG Xia1，2，HAN Wei3，GE Bin2，WU Yong-jie1
(1.Dept of Pharmacology，School of Basic Medical Science，Gansu Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;2 Dept of Pharmacy，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，China; 3.Dingxi Campus of Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Dingxi Gansu 743000，China)

Abstract:AimTo investigate the cytotoxic effect and mechanism of ampelopsin sodium (AMP-Na) on human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 alone or combined with carboplatin (CBP).MethodsThe cytotoxic effect of human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 was investigated by 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay.Ultrastructure change of apoptotic GLC-82 cells was observed with transmission electron microscope.The changes of the cell apoptosis and the expression of caspase-3 were analyzed with flow cytometer.ResultsCombined with AMP-Na，the IC(50)of CBP decreased from (17.10±4.78) mg·L(－1)to＜3.12 mg·L(－1)(P＜0.01)，showed that the combination of AMP-Na and CBP had synergistic effect on GLC-82 cells (CDI＜1).As with transmission electron microscope and flow cytometric analysis，the apoptosis and necrosis ratios also increased in the combination group.The necrosis ratios increased from (2.56± 0.41) % to (71.83±5.43) % (P＜0.01).The expression of caspase-3 was increased significantly after treated with AMP-Na or combined with CBP.Conclusions There is a synergistic cytotoxic effect on GLC-82 cells treated with AMP-Na combined with CBP.Apoptotic cells and necrotic cells are found in GLC-82 cells treated with AMP-Na alone or combined with CBP.One of the mechanisms to induce apoptosis is probably that activation of caspase-3 mediates signal transduction pathway in cells.

Key words:ampelopsin sodium; carboplatin; human lung adenocarcinoma cell line GLC-82; apoptosis; necrosis;caspase-3

作者简介:王霞(1980－)，女，硕士，主管药师，研究方向:药理学、临床药学，Tel: 0931-8281726，E-mail: wangx-2008 @ 163.com;吴勇杰(1955－)，男，教授，博士生导师，研究方向:肿瘤药理学，通讯作者，Tel: 0931-8915092，E-mail: wuyj@ lzu.edu.cn

基金项目:广东省科技厅省部产学研合作项目(No 2007A090302025)

收稿日期:2015－01－31，修回日期:2015－03－10

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0838－06中国图书分类号: R329.24; R329.25; R734.202; R734.205.3; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.020