快速测定植物油胆固醇含量在地沟油筛查中的应用

何文绚等

摘 要 采用皂化气相色谱氢火焰离子检测器法测试了多个植物油样品，发现胆固醇峰被干扰比较严重，很难得出植物油与地沟油胆固醇含量的界定值。采用SPE进行样品前处理，对SPE处理条件进行优化，得出优化条件为称样量0.25 g ，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 作为淋洗液，20 mL 15% 乙醚正己烷 （V/V） 作为洗脱液。用SPE气相色谱氢火焰离子检测器法分析了84个植物油样品和13个地沟油样品中胆固醇含量，测定结果表明，植物油胆固醇含量与地沟油胆固醇含量有明显区别，所有植物油胆固醇含量都小于50 μg/g，13个地沟油样中11个样胆固醇含量大于50 μg/g。因此，采用上述植物油胆固醇测定方法，胆固醇含量超过50 μg/g可判定为疑似地沟油，反之不成立。本方法在0～760 mg/L浓度范围内相关系数R2=0.9999，方法检出限为6.0 μg/g，两个浓度水平（17.7和695 mg/L）的相对标准偏差分别为1.6% 和1.5%，回收率为103%。

关键词 地沟油； 气相色谱； 固相萃取； 植物油； 胆固醇

1 引 言

关于地沟油检测方法研究有许多是通过分析植物油中胆固醇含量来判定是否为地沟油[1～4]，且多采用气相色谱法测定胆固醇。虽然相关文章较多，获得实际植物油胆固醇含量数据却非常有限，气相色谱法测定胆固醇鉴定地沟油在实际应用中还存如不同制样法分析结果相差较大、气相色谱氢离子火焰检测器分析结果明显高于气相色谱质谱联用法等问题。液相色谱质谱联用或气相色谱质谱联用测定胆固醇选择性好，但由于离子化效率对准确定量有很大影响，通常采用同位素内标弥补相关的不足，所以目前灵敏度、精密度、准确度高的胆固醇测定方法应多反应监测同位素内标液质联用[5]和同位素内标气质联用法[6]，但两种方法成本高、操作繁琐，拥有相关仪器的单位较少。地沟油多数情况下混有动物脂肪，也必定含有动物油脂的特征性甾醇——胆固醇，但若不经筛查，直接采用上述同位素内标液相色谱质谱或气相色谱质谱联用方法，由于高昂的成本和相对少的仪器，实际应用中很难操作。高效的做法应是用相对价廉、简单、有效的方法先筛查疑似地沟油，筛出的少量疑似地沟油样品再用成本高、准确性好的方法确证，这样建立的方法才有实际应用基础。胆固醇是地沟油的关键指标之一，可以用其作为筛查指标，筛查阶段不需要太强调获取准确胆固醇含量数据，但需满足以下条件：第一，测得的数据地沟油与植物油要有明显区别；第二，方法重现性好，可以得到明确、误判率低的判定设定值；第三，方法相对简单、经济、省时。基于此，本研究建立了测定植物油中胆固醇含量快速筛查地沟油的方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与样品

GC2014C气相色谱仪，配FID检测器（日本岛津公司）。SPE硅胶柱（500 mg/3 mL，菲罗门科学仪器有限公司）。石油醚（沸程30～60 ℃）、无水硫酸钠、无水乙醇、正己烷、无水乙醚、KOH均为分析纯。

所有菜籽油、葵花油、大豆油、玉米油、芝麻油、花生油、橄榄油都购于大型超市，地沟油都是相关部们查获、有确凿证据的样品。

2.2 胆固醇标液配制

准确称取0.0192 g胆固醇（纯度>99%，美国NUCHEK公司），用正己烷溶解并稀释至25 mL，配制成760 mg/L的胆固醇标准储备液，在4 ℃下保存。根据需要用正己烷稀释成适当浓度标准溶液。

2.3 样品前处理

2.3.1 皂化 称取1.00 g（±0.01 g） 样品，置于烧瓶中，加入1 mol/L KOH乙醇溶液10 mL，在90 ℃水浴锅上皂化1 h，冷却，移入60 mL分液漏斗，以10 mL去离子水洗涤，洗液并入分液漏斗，再以10 mL石油醚洗涤，洗液并入分液漏斗，轻轻振摇，静置分层，分出有机相和水相，水相加入10 mL石油醚振摇，分层后，将石油醚层并入有机相，以10 mL石油醚再提取一次，提取的石油醚并入有机相。用2～3 mL去离子水洗涤有机相，分层，弃去水相， pH试纸检测水相，若pH>7，重复此步骤，直至pH=7。无水Na2SO4干燥后，将石油醚层移入25 mL玻璃蒸发皿，吹干，用正己烷将残余物转移到1.5 mL样品瓶，4 ℃下保存，测试时用正己烷定容。

2.3.2 SPE法条件优化 文献[6]已详细探讨用SPE法测试植物油中胆固醇条件，但未标出所用的SPE小柱基本信息。本研究以该文献为基础，进行SPE条件优化。称取S2（见表1）试样0.25 g（±0.01 g） 于10 mL 具塞比色管中，加入0.1 mL胆固醇标准储备液（760 mg/L）， 用5.0 mL 正己烷溶解后作为上样液。SPE柱内加入1 g无水Na2SO4，10 mL 正己烷活化小柱，弃去流出液，按以下步骤进行上样、淋洗和洗脱：（1）上样 加入上样液，弃去流出液，用5 mL正己烷分3次润洗比色管，润洗液加入柱内，弃去流出液；（2）淋洗 将20 mL 0.6% 乙醚正己烷（V/V）溶液分2次加入，第一次加15 mL，第二次加5 mL，收集5 mL流出液，该淋洗液编号L1；（3）洗脱 将20 mL 15%乙醚正己烷溶液（V/V）分成3次加入，第一次加10 mL，后面两次各5 mL，分别收集流出液，相应洗脱液编号为X1、X2和X3。以上步骤都是用玻璃蒸发皿收集流出液，冷风吹干正己烷，用适量正己烷将蒸发皿中残留物转移到1.5 mL试样瓶，放置在4 ℃冰箱中，测试前用正己烷定容。

2.4 气相色谱分析

色谱柱：Rtx5毛细管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：氮气； 柱流量：130 mL/min； 检测器：FID（温度320 ℃）； 进样口温度：300 ℃； 进样方式： 分流（1∶90）； 程序升温：200 ℃保持5 min； 以20 ℃/min升温至280 ℃，并保持10 min； 再以35 ℃/min升温至310 ℃， 保持5 min。endprint

3 结果与讨论

3.1 SPE条件最佳化

固相萃取方法参照文献[6]，并加以改进：在SPE小柱中添加了无水Na2SO4，将称样量降低至0.25 g，洗脱液乙醚含量从10%增加至15%，采用蒸发皿收集洗脱液并用常温空气吹干，简化了挥干溶剂步骤，花生油318经SPE处理后色谱图如图1。

实验表明，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 淋洗液未将胆固醇洗出（L1未检出胆固醇）；10 mL 15%乙醚正己烷 （V/V） 洗出73.5%的胆固醇（X1胆固醇回收率达73.5%）；当15%乙醚正己烷 （V/V） 洗脱液用量达到15 mL时，胆固醇已全部被洗出（X1+X2胆固醇回收率为103.7%，X3未检出胆固醇）。为了保证胆固醇被完全洗出，选择20 mL 15%乙醚正己烷（V/V）作为洗脱液。

3.2 样品前处理比较

22个样品分别用SPE和皂化法处理，气相色谱氢离子火焰检测器外标法测定胆固醇含量，分析结果见表1。由表1可知，皂化法结果高于SPE法，皂化法很难给出正常油与地沟油胆固醇含量的界定值，目前未发现已发表的国内文献提及该结论； SPE法测试结果中所有植物油胆固醇含量都小于50 μg/g； 地沟油皂化法和SPE法测得的胆固醇含量基本相同，且75%的地沟油样SPE法得到的胆固醇含量高于50 μg/g。表1数据显示许多合格植物油，皂化法测定的胆固醇含量都超过文献 [7] 规定的判别设定值（50 μg/g），说明皂化法不适合用于地沟油的筛查。

3.3 皂化法测试结果高于SPE法的原因探讨

依据文献[8，9]，植物油中甾醇有两种状态：酯化状态和游离状态，皂化法测得的是总胆固醇含量（酯化+游离），SPE法测的只是游离胆固醇含量，文献[8]就是用皂化法测总胆固醇，用SPE法测游离胆固醇，不同植物油酯化和游离甾醇的比例不同，例如葡萄籽油中酯化胆固醇与游离胆固醇比例约为4∶6。皂化法测定的是酯化胆固醇+游离胆固醇含量而SPE法测定的只是游离胆固醇含量，这是皂化法结果高于SPE法的第一个原因；植物油成分复杂[10]，其他植物甾醇、植物醇、未知物等成分的保留时间与胆固醇相近[11]，用气相色谱分析时这些成分时，无法与胆固醇分离，表1中SPE法测得的胆固醇含量明显高于文献 [6]（同样的样品前处理方法及气相色谱分析条件）同位素内标气质联用法，证实了气相色谱氢离子检测器法测定胆固醇存在甾醇等物质的干扰。皂化法由于释放出了酯化甾醇（植物油中有些甾醇含量比胆固醇高1个或几个数量级），将对胆固醇测定产生严重干扰，所以皂化法甾醇类物质的干扰几率和程度都比SPE法高，这是皂化法测试结果高于SPE法的第二个原因；地沟油皂化法和SPE的结果基本相同，这是因为地沟油在加工过程中经历了长时间碱炼，已将酯化的甾醇类物质释放成游离甾醇，所以二者测试结果基本相同，这也验证了前述的第一和第二个原因；皂化法无法消除植物醇的干扰，但SPE法中，植物醇在用5% 乙醚正己烷淋洗时已被除去，因此植物醇的存在是皂化法结果高于SPE法的第三个原因。

3.4 SPE样品前处理气相色谱分析胆固醇方法评价

3.4.1 线性范围 配制7.6， 76， 152， 304和760 mg/L胆固醇溶液，进行线性回归实验。结果表明，胆固醇浓度在0～760 mg/L范围内线性关系良好，所得方程为y=8.926×10 5x+2.658，R2=0.9999。

3.4.2 方法精密度 取植物油样（A6）和地沟油样（地沟油5#）各一个，均按前述方法制样、检测3次，A6样平均胆固醇含量为17.7 mg/L，相对标准偏差为1.6%，地沟油5#样平均胆固醇含量为695mg/L，相对标准偏差为1.5%。

3.4.3 方法回收率

分别称取0.2513和0.2510 g 玉米油S2号样品，其本底胆固醇含量为3.0 μg/g，添加了100 μL胆固醇储备液，制样、检测方法同前，两次测试结果回收率分别为103.6%和102.1%。

3.4.4 检出限 仪器基线3倍噪音面积对应的浓度为仪器检出限，仪器检出限为2.9 μg/L； 同样的样品处理及测试条件只是不加油样，空白的胆固醇测试结果为1.0 mg/L，所以方法检出限为6.0 μg/g。

3.5 大样本量SPE法分析植物油及地沟油胆固醇含量

目前，SPE法结合GC（FID）获得的植物油胆固醇数据十分有限，为了使测定结果更具有统计学意义，选择了84个合格植物油和13个地沟油样，按上述方法检测其胆固醇含量，检测结果见表2。

表2表明，测定的84个植物油样，其胆固醇含量都小于50 μg/g，13个地沟油样中只有3个样品胆固醇含量小于50 μg/g，其他都大于50 μg/g。

3.6 SPE气相色谱法筛查植物油中地沟油

用本研究建立的SPEGC（FID）法测定7种常用植物油或由7种植物油调制的调和油胆固醇，含量超过50 μg/g可判定为疑似地沟油，其误判率低（84个样品中，误判率为0），筛查出的样品需用同位素内标液质联用，或内标气质联用法检测其胆固醇的准确含量或用其他地沟油检测方法验证，方可判定是否是地沟油或添加了地沟油，反之胆固醇含量低于50 μg/g无法得出其不是地沟油的结论。

4 结 论

胆固醇是动物油的特征甾醇，本方法采用硅胶SPE小柱（500 mg/3 mL）， 称量0.25 g（±0.01 g），正己烷溶解，1 g无水硫酸钠加入SPE小柱除痕量水， 正己烷活化，20 mL 5% （V/V）乙醚正己烷淋洗，20 mL 10%（V/V） 乙醚正己烷 脱，气相色谱（FID）测定植物油胆固醇，含量超过50 μg/g可判定为疑似地沟油；含量低于50 μg/g不能判定不是地沟油或未添加地沟油。本方法在0～760 mg/L浓度范围内相关系数R2=0.9999，方法检出限为6.0 μg/g，两个浓度水平（17.7和695 mg/L）的相对标准偏差分别为1.6%和1.5%，回收率为103%。本方法误判率低、简单、测试时间短且分析成本相对低，方便大量样本分析，适合于地沟油筛查。endprint

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Abstract The contents of cholesterol in a number of vegetable oils were determined by saponificationgas chromatography （FID）. There was quite a large possibility that cholesterol peak was seriously interfered by saponificationgas chromatography （FID）， so it was difficult to set a cholesterol content value to differentiate vegetable oil from waste oil. Solid phase extraction （SPE） sample pretreatment was chosen and the process conditions were optimized. The optimal conditions were as follows： 0.25 g of oil samples， 20 mL of 0.6% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （get rid of fatty acid glycerides） and 20 mL of 15% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （obtain cholesterol）. An obvious cholesterolcontentdifference between vegetable oils and waste oils was found by SPEGC. The detected cholesterol contents in 84 vegetable oil samples were all less than 50 μg/g and the contents of 11 waste oil samples among the 13 waste oils were greater than 50 μg/g. Therefore， cholesterol content in vegetable oil of more than 50 μg/g could be determined as suspected waste oil， not vice versa by SPEGC. The correlation coefficient R2 was 0.9999 in 0-760 mg/L concentration range， and the detection limit was 6.0 μg/g. Relative standard deviations at two concentration levels of 17.7 and 695 mg/L were 1.6% and 1.5% respectively. The recovery was 103%.

Keywords Waste oil； Gas chromatogray； Solid phase extraction； Vegetable oil； Cholesterolendprint