同位素稀释—固相萃取—LC/MS/MS法测定婴幼儿配方食品中双酚类化合物

高梦婕等

摘 要 建立了同位素稀释固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中14种双酚类化合物的方法。婴幼儿配方乳粉、婴幼儿配方谷粉和婴幼儿辅食果泥等试样经乙腈提取，ProElut PLS 固相萃取小柱（500 mg/6 mL）净化，14种双酚类化合物经Waters Atlantis T3 色谱柱（150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）分离后，正负离子同时扫描模式下多反应监测（MRM），基质匹配BPAd16、TBBPAd10和BPSc13同位素内标法定量。结果表明，在线性范围内，14种双酚类化合物线性相关系数（r）均大于0.999，回收率为83.0%～107.1%（n=6）， 相对标准偏差（RSD）为5.1%～9.8%（n=6），方法的定量限（LOQ）为1.0～2.0 μg/kg，检出限（LOD）为0.3～0.7 μg/kg。方法操作简单、高效、重现性好，满足现行法规要求的同时，实现了婴幼儿食品中双酚类化合物的定性定量检测。

关键词 双酚类； 婴幼儿食品； 高效液相色谱串联质谱法； 同位素稀释

1 引 言

随着消费者对健康、营养追求越来越高，尤其是对婴幼儿食品的高度重视，目前市场上婴幼儿配方食品种类越来越多，如婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方谷物粉、婴幼儿配方米粉、婴幼儿辅食果泥等。在婴幼儿食品制造过程中不可避免使用的接触性包装材料中双酚类化合物会迁移到食品中，严重危害婴幼儿的大脑发育和免疫遗传功能[1～6]。双酚类化合物主要包括双酚A（BPA）及环氧化物、双酚F（BPF）及环氧化物、双酚S（BPS）、四氯双酚A（TCBPA）和四溴双酚A（TBBPA）等，属内分泌干扰物，具有拟雌激素活性，微量甚至痕量即可能对人类和动物的生殖系统以及胎儿发育造成不良影响[3～6]。由于配方食品为婴幼儿的主要营养来源，对婴幼儿配方食品双酚类化合物迁移带来的食品安全问题也越来越受到重视。

目前，对于双酚类化合物的迁移限量规定并不完善。欧盟法规（EC/1895/2005号指令）规定， 自2006年1月1日以后禁止在食品接触的涂料中使用双酚F二缩水甘油醚（BFDGE），并规定双酚A二缩水甘油醚（BADGE）、双酚A（2，3二羟基丙基甘油醚）（BADGE H2O）和双酚A双（2，3二羟基丙基醚）（BADGE2H2O）在食品或食品模拟物中的迁移总量不超过9 mg/kg，单一各类在食品或食品模拟物中的迁移总量不超过1 mg/kg[7]。同时，欧盟塑料法规（EU No.10/2011）和我国国家标准（GB96852008）均规定双酚S在食品或食品模拟物中的迁移限量为0.05 mg/kg[8，9]。我国行业推荐性标准（SN/T 31502012）对出口食品中BADGE、BFDGE及其衍生物测定方法的定量限（LOQ）为10 μg/kg[10]。

双酚类化合物检测涉及测定样品有环境水样、土壤、生物、食物等[11～17]，但婴幼儿食品中同时测定10余种双酚类化合物的方法还未见报道。同时迁移到婴幼儿食品中的双酚类化合物通常是痕量的，且复杂的基质会对目标物的分析造成干扰。液相色谱质谱联用法具有灵敏度高、选择性好、检出限低的特点。同位素稀释法已被广泛用于痕量污染物的定量研究，可以有效提高方法的稳定性和准确度[6，17]。本研究采用固相萃取进行前处理，同位素内标稀释，高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）同时测定婴幼儿食品中14种双酚类化合物的迁移量，电喷雾离子化正模式（ESI+）和负模式（ESI

）同时扫描，用时少， 操作简单， 适用范围广泛。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

API4000型四极杆串联线性质谱仪（美国AB公司）； UFLC XR高效液相色谱仪（日本岛津公司）； 电子分析天平（精度为0.0001 g，德国Sartorius ME公司）； XW80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）； MilliQ超纯水一体机（Millipore公司）； NEVAP氮吹仪（美国Organomation公司）； 固相萃取仪（美国Supelco公司）； Allegia X22R高速冷冻离心机（Beckman公司）； ProElut PLS 固相萃取小柱（500 mg/6 mL， Dikma公司）； 0.22 μm有机相滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

BPA和BPF标准品（纯度>95%，日本TCI公司）； BFDGE标准品（纯度>95%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）； BPS标准品（纯度>99%，美国Admas公司）； BADGE、BADGEH2O、BADGE2H2O、双酚A（3氯2羟丙基甘油醚）（BADGEHCl）、双酚A双（3氯2羟丙基）甘油醚（BADGE2HCl）、双酚A（3氯2羟丙基）（2，3二羟丙基醚）（BADGEH2OHCl）、双酚F双（2，3二羟基丙基醚）（BFDGE2H2O）、双酚F双（3氯2羟丙基）甘油醚（BFDGE2HCl）、TCBPA和TBPBA标准品（纯度>98%，瑞士Fluka公司）。乙腈、甲醇（ACS纯，美国Merck公司）； 甲酸（ACS纯，J.T.Baker公司）； 3种同位素内标购自上海市化工研究院，双酚A内标（BPAd16），四溴双酚A内标（TBBPAd10）（100 mg/L）和双酚S内标（BPSc13）（纯度>96%）； 实验用水经Millipore系统处理的超纯水。

婴幼儿配方食品罐取自不同的生产企业， 均为未接触过食品。

2.2 标准溶液的配制

分别准确称取0.0100 g 标准品于10 mL容量瓶中， 用甲醇溶解并定容， 4 ℃下保存。BPA， BPF， BADGE， BADGEH2O， BADGEHCl， BADGE2H2O， BADGEHClH2O， BADGE2HCl， BFDGE， BFDGE2H2O， BFDGE2HCl， BPS， TCBPA和TBBPA标准储备液浓度为1.000 g/L。用甲醇稀释为10 mg/L混合标准溶液，避光于4 ℃保存。根据需要移取混合标准溶液，甲醇水（1∶1， V/V）稀释，配制成0.5， 1.0， 2.0， 10.0和50.0 μg/L系列标准溶液。其中，内标BPAd16， TBBPAd10和BPSc13的浓度分别为25， 50和25 μg/L。endprint

2.3 样品前处理

称取均质样品2 g于10 mL玻璃离心管中，加入3 mL水、2 mL乙腈， 涡旋振荡1 min， 4000 r/min 离心5 min， 取上层澄清液净化。依次用5 mL乙腈和5 mL甲醇水（1∶1， V/V）溶液活化 PLS 固相萃取小柱， 调节流速约2～3 mL/min； 将玻璃离心管中的上层澄清液转入固相萃取小柱， 弃去流出液； 再用5 mL水淋洗， 弃去流出液； 用5 mL 乙腈洗脱， 洗脱液收集于试管中， 40 ℃下氮吹至近干； 用1 mL含0.1%甲酸的甲醇水（1∶1， V/V）定容， 并于涡旋混合器上混匀， 过0.22 μm滤膜过滤后， 供液相色谱串联质谱检测。

2.4 色谱质谱条件

液相色谱条件： Waters Atlantis T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.0 μm）。流动相A为甲醇， 流动相B为水； 进样量： 10 μL； 流速： 0.25 mL/min； 柱温： 30 ℃。梯度洗脱： 0～4 min， 45% A； 4～8 min， 45%～80% A； 8～14 min， 80% A； 14～18 min， 80%～45% A。

质谱条件： 离子源： 电喷雾离子化正模式（ESI+）和负模式（ESI

）同时扫描； 扫描方式： 多反应监测（MRM）； 电喷雾电压（IS）： 5500 V（ESI+）和4500 V（ESI

）； 雾化气压力（GS1）： 413.8 kPa； 气帘气压力（CUR）： 172.4 kPa； 辅助气压力（GS2）： 413.8 kPa； 离子源温度（TEM）： 500 ℃； CAD： High； 扫描时间： 50 ms。14种双酚类化合物及3种内标物的质谱参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

比较了3种不同类型的色谱柱： Thermo Aquasil C18柱（150 mm × 4.6 mm， 3.0 μm）、Agilent XDBC18柱（100 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）和Waters Atlantis T3柱（150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）对14种双酚类化合物的分离效果。在本实验条件下， C18色谱柱完全洗脱14种双酚类化合物时间较长。而Waters Atlantis T3柱在18 min内即能对14种双酚类化合物形成较好的分离，且峰形和响应值均高于C18柱，对双酚类等极性药物具有较好的保留[6]。故本实验选择T3柱进行分析。

3.2 流动相的选择

比较了甲醇水和乙腈水流动相对目标化合物分离效果的影响。结果表明，以甲醇为有机相时，各待测物响应强度较稳定，且峰形均较好； 而乙腈为有机相时的响应值明显降低，分离度也不佳，不适合同时检测。 故选用甲醇为有机相，对双酚类具有较好的分离效果。流动相比例初始为甲醇水（45∶55， V/V）， 在10 min内，甲醇的比例最高达到80%， 可完全洗脱所有双酚类化合物。14种双酚类化合物正负模式同时扫描多反应监测色谱图见图1。

3.3 质谱条件的优化

取1.0 mg/L 双酚类化合物标准溶液，分别以流动注射的方式在ESI+和ESI

模式下进行电离监测。果表明， BPA， BPF， TCBPA和TBBPA在ESI

模式下有更好的响应，其余10种双酚类化合物在ESI+模式下有更好的响应。在MRM模式下对每种化合物进行一级质谱分析（Q1扫描）， 得到每种化合物的分子离子峰。根据欧盟第2002/657/EC号[18]中有关规定，选择2对离子进行MRM监测。选取相应母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析（Q2扫描），得到碎片离子信息。选取丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性、定量离子，优化去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）等参数条件，以达到最佳灵敏度（见表1）。本方法在ESI+和ESI模式下同时扫描14种双酚类化合物，时间更快，响应度高。

3.4 线性范围与检出限

向空白基质溶液中加入系列混合标准溶液和内标溶液，以峰面积对应的浓度作图。表2结果表明，14种化合物在各自的范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.999。分别以10倍信噪比（S/N>10）和3倍信噪比（S/N>3）计算得到14种双酚类化合物的定量限（LOQ）及检出限（LOD）分别为1.0～2.0 μg/kg及0.3～0.7 μg/kg。14种双酚类化合物的相关系数、线性范围及检出限见表2。

3.5 加标回收率与精密度

选择3种不含双酚类的样品（婴幼儿配方乳粉、婴幼儿配方谷粉、婴幼儿辅食果泥）进行加标回收率实验，添加14种双酚类标准品，进行3种水平的标准添加回收实验，结果见表3，平均回收率为83.0%～107.1%（n=6），回收率情况良好，相对标准偏差（RSD）为5.1%～9.8%（n=6）。空白乳粉样品低水平下加标和空白乳粉样品的多反应监测（MRM）图谱见图2。

3.6 样品分析

采用本方法对市售的30余种不同品牌的婴幼儿食品（婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方谷粉和婴幼儿辅食果泥）进行测定，在婴幼儿辅食果泥中检出BPA、BADGE2H2O和BADGE2HCL，含量为0.6～5.9 μg/kg，说明双酚类化合物在婴幼儿食品包装材料中痕量存在，并迁移到食品内容物中，但含量相对较低，并未超过欧盟对食品中迁移总量的规定。

上述结果表明， 本方法操作简便、高效、重现性好、回收率佳，满足现行法规要求同时，实现了婴幼儿配方食品中双酚类化合物的定性定量检测，具有实际应用价值。

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Abstract A method based on isotope dilutionsolid phase extraction （SPE） and liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） for the simultaneous determination of 14 bisphenol substances migration in infant food （infant milk powder， infant nutritious cereal and infant supplement puree） was presented. The samples were extracted by acetonitrile followed by ProElut PLS （500 mg/6 mL） to remove matrix interference. The separations of 14 bisphenol substances were performed on a Waters Atlantis T3 （150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）， respectively， in the positive and negative MRM mode by HPLCMS/MS. The quantification was carried out by matrixmatched calibration curve and internal standard （BPAd16， TBBPAd10 and BPSc13）. The results demonstrated that the calibration curves showed good linearity in each range and the correlation coefficients （r） were greater than 0.999. The average recoveries at three spiked levels were ranged from 83.0% to 107.1% with the relative standard deviations （RSD） of 5.1% to 9.8%. The limits of quantitation （LOQ， S/N>10） were 1.0-2.0 μg/kg and the limits of detection （LOD， S/N>3） were in the range of 0.3-0.7 μg/kg. The established method was simple， timesaving and efficient， and could meet the requirements for current regulations while achieving qualitative and quantitative determination of 14 bisphenol substances in infant food.

Keywords Bisphenol substances； Infant food； Liquid chromatographytandem mass spectrometry； Isotope dilution

（Received 1 December 2014； accepted 30 December 2014）endprint