真菌菌株的固定化及其在印染废水处理中的应用

贺晓凌，徐 磊，王 宁，刘 蓉，刘恩秀

（1.天津工业大学环境与化学工程学院，天津 300387；2.天津市水质安全评价与保障技术工程中心，天津 300387；3.天津市庆烁环保工程有限公司，天津 300451）

真菌菌株的固定化及其在印染废水处理中的应用

贺晓凌1，2，徐 磊1，王 宁1，刘 蓉1，刘恩秀3

（1.天津工业大学环境与化学工程学院，天津 300387；2.天津市水质安全评价与保障技术工程中心，天津 300387；3.天津市庆烁环保工程有限公司，天津 300451）

以聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）为载体材料，制备PVA凝胶小球对所筛选的真菌进行固定，对PVA小球的机械稳定性、化学稳定性、溶胀性、渗透性、微观结构以及细胞毒性进行测试，并以固定化真菌对不同合成染料废水和工厂印染废水进行脱色研究.结果表明：PVA小球具有较高的机械和化学稳定性，渗透性良好，细胞毒性较低；菌株对直接湖蓝5B、直接耐晒大红4BS为吸附脱色，5 d后脱色率分别达到92%和59%，而对酸性大红3R和工厂印染废水为降解脱色，5 d后脱色率均达到90%左右；固定化菌株经4次重复利用后，对酸性大红3R的脱色率仍超过92%，显示出良好的重复利用性.

真菌；固定化；印染废水处理；脱色

合成染料品种繁多、结构复杂、化学稳定性好、生物可降解性差，部分合成染料具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用，是纺织工业和染料生产废水中的主要污染物[1].目前染料的世界年产量近8×105t，其中50%以上是偶氮染料.由于偶氮染料及其降解产物芳香胺具有致癌性，因此，水体中偶氮染料的去除就变成一个十分重要的研究课题[2].废水处理技术主要包括物理法、化学法和生物法.其中，物理法包括吸附法、膜分离技术、超声波空化法和混凝法，化学法包括高级氧化法和电化学法，这些处理方法存在成本高、适应性有限、容易二次污染及产生大量难处理污泥等缺点[3-4].而生物处理法具有操作简单、运行费用低、无二次污染、对环境友好等优点，越来越受到人们的重视[5].固定化微生物处理废水技术是利用化学或物理手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使之不悬浮于水、仍保持生物活性、可反复利用的方法[6].固定化微生物法与游离微生物法相比，其优点有:在强酸强碱、高温低温、存在有机溶剂和有毒化合物等恶劣的环境条件下保护细胞；相对容易分离；可重复利用；增加细胞密度；降低外界微生物污染的敏感性[7].因此，固定微生物法处理废水的工作近年来得到广泛关注.聚乙烯醇（PVA）水溶液在室温下可以通过氢键形成水凝胶，并且化学性质不活泼，毒性低，耐生物老化，机械性能优良，吸水量高，生物相容性好，在包埋微生物处理废水方面得到广泛应用[8].然而，以固定化真菌处理印染废水的研究还较少.本文以聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）为载体材料，对所筛选的具有较强脱色能力的真菌进行包埋，对PVA小球的性能进行研究，并考察固定化菌株对不同合成染料废水以及工厂印染废水的处理效果.

1 实验部分

1.1 材料和设备

所用原料包括:酸性大红3R（单偶氮酸性染料），直接湖蓝5B（双偶氮直接染料），直接耐晒大红4BS（双偶氮直接染料），天津工业大学纺织学院提供；印染废水，所含染料为单偶氮酸性染料，天津创业环保集团股份有限公司提供；聚乙烯醇（PVA），平均聚合度1 750±50，天津市光复精细化工研究所提供；海藻酸钠，天津市光复精细化工研究所提供；硼酸，天津市光复科技发展有限公司提供；氯化钙，天津大学科威公司提供；改良型R/MINI-1640培养基，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司提供；噻唑蓝（MTT），美国Sigma公司提供；其它试剂均为国产分析纯.

所用仪器包括:STARTER 3100型实验室pH计，奥斯特仪器（上海）有限公司产品；数显磁力搅拌器，巩义市英峪仪器厂产品；H1650-W型台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；热空气消毒箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；数显恒温气浴振荡器，金坛市荣华仪器制造有限公司产品；JJ-CJ-1FD型垂直流洁净工作台，苏州市金净净化设备科技有限公司产品；YX-18LDJ型手提式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司产品；721G型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；Evolution 201型紫外可见分光光度计，赛默飞世尔科技（上海）有限公司产品；Quanta 200型环境扫描电子显微镜，捷克FEI公司产品；FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技发展股份有限公司产品；MK3型全自动酶标仪，美国Thermo Labsystems公司产品.

1.2 菌的筛选与培养

取贵州六盘水市采集的土样，用蒸馏水配成菌液，涂覆到印染废水培养基上，常温下培养2～3 d，待印染废水培养基上生长出菌丝，把筛出的真菌接种到灭过菌的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，接种过程采用无菌操作，于4℃保存.

1.3 PVA小球的制备

PVA小球的制备参照文献[9]方法.称取一定质量的PVA和海藻酸钠加入到蒸馏水中，90℃水浴溶解，溶液中PVA和海藻酸钠的最终质量分数分别为10%和0.8%，形成包埋剂溶液；将质量分数3%的CaCl2溶解于饱和硼酸溶液中配制交联剂，降温至4℃；用注射器将混合均匀的包埋剂从10 cm的高处滴入饱和硼酸和氯化钙的混合水溶液中，轻轻搅拌0.5 h，形成凝胶小球；将所得凝胶球用生理盐水洗涤2次，于4℃保存.

1.4 PVA小球的性能测试

（1）机械稳定性.在室温下，取50粒已经达到溶胀平衡的PVA小球，称其湿重，加入到100 mL蒸馏水中，室温下磁力搅拌4 d，每天记录小球湿重.

（2）化学稳定性[10].以盐酸（HCl）制备pH值为1～6的酸溶液，以氢氧化钠（NaOH）制备pH值为8～13的碱溶液，将PVA小球分别浸泡在不同pH值溶液中60 h后，以去离子水充分漂洗，并进行干燥，直至其质量不再变化为止，记录其质量.

（3）溶胀性[11].在室温下，将称重后的干燥PVA小球浸入蒸馏水中，直至其达到溶胀平衡，然后以湿润的滤纸除去表面水分，将样品称重.通过公式（1）计算溶胀率:

式中:W0为干燥PVA小球质量；Wt为PVA小球溶胀状态下质量.

（4）渗透性.将PVA凝胶小球浸入到50 mg/L的酸性大红3R溶液中，在室温下放置，小球浸入溶液不同时间后，以紫外可见分光光度计在波长为505 nm处测定溶液的透射率，用其表征凝胶小球的渗透性.

（5）细胞毒性.称取PVA小球1 g加入到10 mL改良型R/MINI-1640培养基中，于37℃浸提24 h，过滤除菌后即为体积分数100%供试品浸提液，用完全培养基分别稀释40、20、10、5倍，作为供试品浸提液，并用完全培养基作空白对照组.将制备好的HepG2（人肝癌细胞）悬液（细胞密度为1×105个/mL）100 μL接种于96孔培养板内；待细胞贴壁后，弃去上清液，加入供试浸提液150 μL，并设空白对照组；每孔设5个复孔，于37℃5%CO2孵箱中培养48 h，然后加入5 mg/mL MTT液20 μL，继续在37℃5%CO2孵箱中培养4 h.取出培养板，小心吸去每孔内的培养液；然后加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），置于振荡器上振荡10 min，混合均匀.用全自动酶标仪测定光密度，按公式（2）计算相对细胞活性:

式中:A为有小球浸提液的孔中测得的吸光度，即实验组；A0为无小球浸提液的孔中测得的吸光度，即对照组.

（6）扫描电子显微镜（SEM）分析.PVA小球冷冻干燥后，用刀切开，然后将样品喷金2～3 min，用扫描电子显微镜观察PVA小球的断面和表面形态.

1.5 脱色实验

（1）菌株的固定化.将真菌接入100 mL马丁氏培养基，在27℃、150 r/min条件下培养48 h，5 000 r/min离心5 min，用生理盐水洗涤2次，重悬得到5 mL浓缩菌液.然后将菌液与冷却至室温的包埋剂混合均匀，滴入到交联剂中制成小球作为固定化菌株，操作方法同1.3所述.

（2）固定化菌株对染料的脱色处理.分别在250 mL三角烧瓶中加入100 mL各自由直接湖蓝5B、直接耐晒大红4BS、酸性大红3R制成的染料培养基（染料质量浓度50 mg/L，葡萄糖1 g，（NH4）2SO40.4 g，KH2PO40.2 g，蒸馏水100 mL）和印染废水（稀释20倍）.分别称取3 g（干重）固定化菌株加入到各染料培养基中，于27℃以150 r/min在摇床上震荡培养5 d，离心后取上清液，用可见分光光度计在λmax处测定吸光度值，考察固定化菌株对不同染料的脱色能力.作为对照，将等量未包埋菌株的PVA小球加入到酸性大红3R培养基中，培养条件相同.按公式（3）计算染料的脱色率[12]:

式中:A为不接种固定化菌株的染料培养基吸光度；B为接种固定化菌株的染料培养基吸光度.

（3）PVA小球的重复利用.待酸性大红3R染料培养基完全脱色以后，取出溶液中固定化菌株的小球，用蒸馏水清洗2次，加入到100 mL同组分的染料培养基中，依次重复4次，每组实验培养2 d后，取上清液离心，测其吸光度.

1.6 染料降解分析

酸性大红3R染料脱色完成后，在10 000 r/min离心5 min，取其上清液，使用紫外-可见分光光度计在波长为400～800 nm范围内分别对酸性大红3R染料及其降解产物进行吸收光谱扫描.取上清液，用等体积的乙酸乙酯提取出降解产物，将萃取液用无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器中蒸发至干，将得到的降解产物与酸性大红3R染料分别进行傅里叶变换红外光谱分析.

2 结果与讨论

2.1 机械稳定性

在固定化真菌的使用过程中，为了保证其能长期稳定的运行，固定材料需要有较好的机械稳定性.因此，本文对PVA小球的机械性能进行了研究，结果如图1所示.

图1 PVA小球的机械稳定性Fig.1 Mechanical stability of PVA beads

由图1可以看出，PVA小球的质量保留率随时间有小幅度下降，4 d后保留率为89.19%，保持在较高水平.PVA小球经过4 d的持续搅拌后仍能保持球形，没有发生破碎现象，小球仅有少量带气上浮，大部分未上浮，但小球直径有所增大，是由于吸水溶胀所致.由此表明，PVA小球的机械强度和韧性较强，能耐受较大的机械波动，具有较好的机械稳定性，能适应长时间稳定运行.

2.2 化学稳定性

化学稳定性是衡量PVA小球实际应用性能的一个重要指标，因为在实际废水的处理中，不同类型的废水pH值不同，不同废水的组份差异也很大.图2所示为不同pH值下PVA小球的化学稳定性.

图2 PVA小球的化学稳定性Fig.2 Chem ical stability of PVA beads

由图2可知，pH值为5～6和11～13时，PVA小球的化学稳定性最高，剩余质量都在原质量的80%左右. PVA小球的数量在整个实验期间保持恒定，且没有发生破裂现象，这表明小球具有良好的化学稳定性.

2.3 PVA小球的溶胀性

PVA小球的溶胀率随时间变化的曲线如图3所示.

图3 PVA小球的溶胀率Fig.3 Swelling ratio curve of PVA beads

由图3可以看出，在初始溶胀阶段，小球快速吸水，溶胀率随时间急剧增加，1 000 min时，达到溶胀平衡.对PVA小球的溶胀动力学进行分析，假设溶胀过程满足一级动力学方程:

式中:t为溶胀时间；Qt为小球在时间t时的溶胀率；Qe为平衡溶胀率；d Qt/d t为溶胀速率；k为溶胀速率常数.溶胀动力学方程可以通过对上述方程积分获得:

绘制ln[（Qe-Q0）/（Qe-Qt）]对时间t的曲线，如图4所示，溶胀速率常数k即为曲线的斜率.

图4 PVA小球的溶胀动力学Fig.4 Swelling kinetics of PVA beads

由图4可以看出，ln[（Qe-Q0）/（Qe-Qt）]与时间t显示出良好的线性关系，说明PVA小球的溶胀过程动力学遵循一级动力学规律.

2.4 渗透性

图5所示为PVA小球对酸性大红3R的渗透曲线.由图5可以看出，酸性大红3R溶液在波长505 nm的透射率随小球浸入时间的延长而增大，5 h后达到一个平衡状态，随后又减小达到另一个平衡状态，这表明小球具有良好的渗透性.另一方面，可以看出PVA小球只能吸附少量的酸性大红3R.

图5 PVA小球的渗透性Fig.5 Permeability of PVA beads

2.5 细胞毒性测试

采用MTT法对PVA小球的细胞毒性进行测试，结果如表1所示.

表1 PVA小球的细胞毒性Tab.1 Cytotoxicity grade of PVA beads

由表1可知，相对于对照组，实验组吸光度值较低，随浸提液体积分数升高，细胞增殖率降低，细胞毒性由1级升至2级，这说明PVA小球对细胞具有轻微毒性，但毒性不大，在可使用范围内.分析PVA小球对细胞具有轻微毒性的原因，可能是由于在小球制备过程中引入的硼酸对细胞具有一定的毒性所致.

2.6 PVA小球微观结构分析

PVA小球的表面及内部形貌如图6所示.

图6 PVA小球的外表面和内切面形貌Fig.6 SEM images of surface and cross section of PVA beads

由图6可以清晰地看到，小球的外表面分布着较多孔洞，但孔径较小；小球内部为孔径均匀的多孔结构，且大孔的壁上出现大量的微孔隙.这种结构不仅可以阻止大分子有毒有害物质对小球内部固定化微生物的毒害，也有助于内部微生物有效地获取营养物质和溶解氧，并为微生物代谢产物提供了运输通道.

2.7 固定化真菌对不同染料的脱色效果

固定化菌株对不同染料及印染废水的脱色率如图7所示.

图7 染料脱色率Fig.7 Decolourization rate of dye

由图7可以看出，固定化菌株对直接湖蓝5B和直接耐晒大红4BS的脱色率1 d后分别达到91%和56%，5 d后分别为92%和59%，第1天和第5天的脱色率无显著区别，说明对二者的脱色为吸附脱色，在第1天就达到了吸附平衡；随处理时间延长，固定化菌株对酸性大红3R和印染废水的脱色率呈上升趋势，5 d后脱色率均达到90%左右，说明菌株对于酸性大红3R和印染废水为降解脱色，菌株对染料的脱色效果存在时间效应.由图7还可以看出，在相同条件下培养5 d，未包埋菌株的空白PVA小球对酸性大红3R的脱色率仅为10.7%，游离态真菌对酸性大红3R的脱色率为54.4%，这说明包埋剂本身对酸性大红3R的吸附脱色效果非常小，固定化菌株对染料的脱色作用大部分由菌株产生，而非包埋剂产生，且固定化真菌的脱色效率要高于游离态.酸性大红3R与印染废水中所含染料均为单偶氮染料，而直接耐晒大红4BS与直接湖蓝5B为双偶氮染料.由此可知，此菌株对单偶氮染料具有很好的降解脱色效果，而对双偶氮染料则以吸附脱色为主，降解效果不是很理想.

2.8 染料降解分析

为进一步确定菌株对酸性大红3R的脱色机理，对酸性大红3R经菌株处理前后的化学组成进行紫外、红外分析，结果如图8、图9所示.

图8 酸性大红3R降解前后的紫外谱图Fig.8 UV-vis spectra of Acid Red 3R before and after biodegradation

图9 酸性大红3R降解前后的红外谱图Fig.9 FTIR spectra of Acid Red 3R before and after biodegradation

由图8紫外光谱图可知，酸性大红3R染料经菌株处理后，在505 nm处的特征吸收峰消失.染料经菌株处理后脱色有两种可能，吸附脱色或降解脱色，如果是吸附脱色，紫外吸收峰的峰强度会减小，而生物降解脱色则会使特征吸收峰完全消失，或者出现新峰，由此可见菌株对酸性大红3R的脱色作用为降解脱色.由图9红外光谱图可以看出，染料脱色前在1 488 cm-1处出现的特征峰，在3 430 cm-1处出现-OH伸缩振动峰；而染料脱色后，1 488 cm-1处的特征峰消失，在3 424 cm-1、3 228 cm-1处出现了2个明显的吸收峰，为—NH伸缩振动峰.这些结果表明染料中偶氮键消失，生成了新的—NH键，证实本文菌株对酸性大红3R的脱色作用为降解脱色.

2.9 PVA小球的重复利用性

真菌在固定化以后，其过滤和转移更加方便，使重复利用成为可能，同时也能极大地减少固体废物的产生.重复利用PVA小球对酸性大红3R染料进行脱色的脱色率变化情况如图10所示.

图10 PVA小球的重复利用性Fig.10 Reuse of PVA beads

PVA小球在重复利用过程中，其数量没有变化，没有破裂现象，且小球尺寸变化不大.由图10可知，PVA小球在重复利用过程中，比第一次脱色速率加快，且脱色率都超过92%.包埋过程中，化学试剂会对真菌细胞结构造成一定的损伤，抑制其生长和产酶，所以第一次脱色效率较低；经过第一次培养处理，真菌得以生长和恢复，产酶能力加强，脱色效率也得到了提高.4次重复循环实验后仍保持较高的脱色能力，表现出良好的重复利用性.

3 结论

本文以聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）为载体材料，成功制备PVA凝胶小球.对PVA小球的机械稳定性、化学稳定性、溶胀性、渗透性、细胞毒性进行了研究，并对小球的微观结构进行了分析.以PVA小球包埋真菌菌株，对不同合成染料废水以及工厂印染废水进行脱色研究.结果表明:

（1）PVA小球具有较高的机械和化学稳定性，渗透性良好，细胞毒性较低；PVA小球内部为多孔形貌，有利于真菌的生长，且有助于营养物质与代谢产物的传输.

（2）固定化菌株对双偶氮染料直接湖蓝5B、直接耐晒大红4BS为吸附脱色，而对单偶氮染料酸性大红3R和印染废水所含染料为降解脱色.

（3）对固定化菌株进行重复利用，重复过程中脱色速率明显加快，2 d后脱色率超过92%，且可重复次数较多，这将大大减轻印染废水处理过程中资源浪费、固体废物多的困扰.

（4）本文研究成果为印染废水处理菌群增添新的菌株，并且通过菌株的固定，可以克服传统污水生物处理工艺中生物量浓度偏低、不耐冲击负荷、污泥上浮膨胀和流失等缺陷，提高废水处理效率，具有较高的实际应用价值和现实意义.

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Immobilization and application of fungus in dyeing-wastewater treatment

HE Xiao-ling1，2，XU Lei1，WANG Ning1，LIU Rong1，LIU En-xiu3
（1.School of Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Engineering Center for Safety Evaluation of Water Quality&Safeguards Technology，Tianjin 300387，China；3.Tianjin Qingshuo Environmental Engineering Limited Company，Tianjin 300451，China）

The fungus screened from soil was enclosed in the hydrogel beads made from polyvinyl alcohol and sodium alginate.PVA beads were investigated in terms of chemical stability，mechanical stability，swelling ratio，permeability，microstructure and cytotoxicity.The decolorization efficiency of the immobilized fungus on different artificial dyeing wastewater and real dyeing water from plant were investigated.The results revealed that the PVA beads have high mechanical and chemical stability，good permeability，low cytotoxicity.The decolorizations of direct sky blue 5B and direct fast scarlet 4BS were mainly due to the adsorption of dyes by fungus and the decolorization rate of dye reached 92%and 59%after 5 days，respectively.However，the decolorizations of acid red 3R and real dyeing wastewater from plant were caused mainly by the biological degradation and the decolorization rate of dye both reached about 90%after 5 days.Furthermore，immobilized fungus exhibited excellent reusability and its decolorization rate for acid red 3R reached 92%after four repeat using.

fungus；immobilization；dyeing-wastewater treatment；decolorization

X791

A

1671－024X（2015）04－0012－06

10.3969/j.issn.1671-024x.2015.04.003

2015-04-22

国家自然科学基金资助项目（31170076）

贺晓凌（1971—），女，副教授，硕士生导师，研究方向为微生物法污水处理及环境功能材料的开发与利用. E-mail:hexiaoling@tjpu.edu.cn