银杏内酯B对视神经钳夹伤后大鼠视网膜神经节细胞的保护作用*

郑幼平 吴小桃 田原 张晓明 周小娟 孟晶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一种威胁视神经视觉功能的眼病，具体发病机制尚不清楚。一般认为视神经损伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）是以细胞凋亡的形式减少，寻找有效药物减轻或延迟视神经损害，是研究视神经损伤的一个主要方面[1-3]。银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是银杏叶提取物中主要的活性成分。前期研究证实GB能够上调Bcl-2/Bax比值，从而降低细胞内Ca2+浓度，实现保护体外培养的视网膜神经细胞作用，并对N-甲基-N-亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）诱导的实验性大鼠视网膜变性所致的视网膜光感受器细胞损伤和视功能损害具有抑制作用[4-6]。为进一步探讨银杏内酯B对大鼠视神经钳夹伤后视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用进行了本研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取出生46 d的SD大鼠（中山大学实验动物中心提供）36只，雌雄不拘。全部饲养于标准鼠笼中，维持12 h白昼，12 h夜晚时间周期。

1.2 视神经钳夹伤建模方法 以1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，按Nakazawa等[7]的方法暴露视神经；剪开外眦角，沿角膜缘外1 mm剪开球结膜，向后钝性分离暴露视神经。用头部宽1 mm，长18 mm的微血管止血钳（上海医疗器械有限公司）夹持10 s，直接检眼镜观察视网膜，视网膜无缺血性改变者为成功模型；缝合球结膜和外眦角，涂金霉素眼膏。术中注意尽可能钝性分离球后筋膜组织并避开血管，减少对眼球血液供应的影响，同时注意原位操作，尽可能减少对视神经的牵拉。

1.3 处理方法 A组（正常对照组）不经任何处理；B组（模型组）、C组（GB治疗组）大鼠暴露并钳夹视神经；B组实验前1周每日腹腔注射NS，容积参照GB的剂量（40 mg/kg），造模后继续腹腔注射NS直至处死。C组实验前1周腹腔注射GB 40 mg/kg（广州市药检所提供），于造模后继续腹腔注射1周直至处死。三组分别在术后1周，F-VEP检查后随机处死大鼠行HE染色光镜检查，每组各4只，其余2周后作RGCs计数。

1.4 闪光视觉诱发电位（F-VEP）每组随机抽取8只大鼠，采用BIO-2000型视觉电生理检查系统（重庆贝澳电子仪器有限公司）检查闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potentials，F-VEP）。检查时关闭照明，暗适应10 min后，进行双眼F-VEP采集。背景参数：Ganzfeld闪光刺激器，光强为10 db，刺激频率为1.9 Hz单闪刺激模式，波形叠加80次，阈值设定为50 mV。主要观察AP1（N1-P1振幅）和LP1（P1波潜伏期），振幅的大小以微伏（μV）为单位，潜伏期以毫秒（ms）为单位，Nl谷底至Pl顶峰为Nl-Pl的振幅值（AP1），起始至P1顶峰的时间为P1峰潜伏期（LP1）。实验数据为3次测量的平均值。

1.5 组织切片制作及RGCs计数 三组分别在造模后1周，F-VEP检查后随机处死大鼠，A、B、C组各4只。造模后2周，处死所有大鼠。在角膜缘12：00位缝线作标记并摘取眼球。立体解剖显微镜下去除眼前节和晶状体后放入4%多聚甲醛溶液中固定过夜，沿纵轴将眼球两边开窗，组织脱水后行石蜡包埋，选取包含视神经的纵切面，沿12：00-6：00经线并沿视神经中央对剖开眼球，连续切片（切片厚度4 μm），行苏木精-伊红（HE）染色。400倍放大倍率的视野显微镜下，从12：00-6：00锯齿缘（经视盘中央），计数整个经线上的RGCs，取其平均值。

1.6 统计学处理 利用统计学软件SAS 6.12对数据进行处理，计量资料采用（x-±s）表示，多组间比较行方差分析，两两比较行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组光学显微镜观察结果 A组HE：神经纤维层较厚，RGCs呈立方形，排列紧密，胞浆丰富，胞核饱满且染色较均匀，神经胶质细胞较少（图1、2）；B组HE：神经纤维层极薄，RGCs稀少，同时神经胶质细胞明显增多（图3、4）；C组HE：RGCs胞体大小正常，数目较正常略少，视神经损伤后2周，神经纤维层轻度变薄（图5、6）。

2.2 三组RGCs数的比较 视神经损伤2周，垂直经线上RGCs计数结果为A组（281±39）个，B组（112±20）个，C组（228±35）个，A、B、C三组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 A组视神经损伤后1周的大鼠视网膜形态（HE×400）

图4 B组视神经损伤后2周的大鼠视网膜形态（HE×400）

图2 A组视神经损伤后2周的大鼠视网膜形态（HE×400）

图5 C组视神经损伤后1周的大鼠视网膜形态（HE×400）

图3 B组视神经损伤后1周的大鼠视网膜形态（HE×400）

图6 C组视神经损伤后2周的大鼠视网膜形态（HE×400）

2.3 三组视神经损伤后1周和2周时的F-VEP比较 视神经损伤后1周，B组较A、C组LPl波延长、AP1降低（P<0.05），C组与A组LP1、AP1比较差异无统计学意义（P>0.05）。视神经损伤后2周，B组的LPl较前1周进一步延长，AP1进一步降低，A、B、C三组LPl、AP1比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、图7。

表1 三组视神经损伤后1周和2周时的闪光视觉诱发电位（±s）

表1 三组视神经损伤后1周和2周时的闪光视觉诱发电位（±s）

*与A组比较，P<0.05；△与B组比较，P<0.05

视神经损伤后2 周组别 视神经损伤后1 周AP1（μV）LP1（ms）AP1（μV）LP1（ms）A 组（n=8）19±3 90±4 21±3 92±11 B 组（n=8）11±3* 110±6* 7±2* 186±15*C组（n=8）18±2△ 94±4△ 14±3*△ 104±12*△F值 20.73 23.17 53.45 128.19 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图7 视神经损伤后1周和2周时的F-VEP注：左侧为损伤后1周，右侧为损伤后2周；上、中、下依次为A、B、C组

3 讨论

视神经钳夹伤后，RGCs经历机械性损伤的快速死亡阶段，剩余存活RGCs发生类似于青光眼视神经病变的慢性损伤过程[8-9]。Dezawa等[10]研究认为视神经损伤后RGCs退化的快与慢，存活时间的长与短，和RGCs轴突的再生潜力有直接的关系，存活时间越长，其再生潜力越大。视神经损伤后，若能够采取积极有效的治疗措施减少和延缓RGCs在细胞快速丧失期的退变，就可能会明显提高视神经功能的恢复[11-12]。

术后1周和术后2周的大鼠视网膜组织HE染色切片，光学显微镜下观察可见：正常对照组神经纤维层较厚，RGCs呈立方形，排列紧密，胞浆丰富，胞核饱满且染色较均匀，神经胶质细胞较少；模型组神经纤维层变得极薄，RGCs胞体减小，数目稀少，同时神经胶质细胞明显增多；GB治疗组术后1周，神经纤维层厚度基本正常，RGCs胞体大小正常，数目较正常略少，术后2周，神经纤维层轻度变薄。模型组视神经钳夹伤后，RGCs形态和数量均明显受损。而GB治疗组与模型组比较，RGCs胞体大小正常，数目仅轻度减少。应用术后2周的大鼠视网膜组织HE染色切片，400倍的光学显微镜下直接计数各组大鼠视网膜整个垂直经线上（12：00-6：00）经视盘中央的RGCs数目：正常对照组（281±39）个，模型组（112±20）个，GB治疗组（228±35）个。模型组RGCs数目较正常组明显减少，而GB治疗组RGCs数目明显优于模型组。以上研究结果初步证明GB能改善视神经钳夹伤后RGCs存活数量和时间。

F-VEP是以闪光刺激视网膜在大脑枕叶皮层而诱发的一组电信号，反映视觉信息在视路中传导的总体情况，是客观评价视功能的重要参考指标[13]。主要观察指标为主波的潜伏期及幅值，潜伏期的长短反应髓鞘的器质完整性和功能状态，振幅的高低反应轴索的功能状态[14]。正常视神经纤维在筛板后有髓鞘，其神经冲动的传导为跳跃式；视神经损伤时，髓鞘变性脱落，潜伏期延迟且振幅降低[15]。

本研究F-VEP的测定中采用全视野单闪刺激模式，刺激的强度和频率易于控制。结果显示，视神经损伤后1周，A、B、C三组的Pl波的潜伏期和振幅分别 为 [（90±4）ms，（19±3）μV]、[（110±6）ms，（11±3）μV]和 [（94±4）ms，（18±2）μV]； 视 神经损伤后2周，A、B、C三组的Pl波的潜伏期和振幅分别 为 [（92±11）ms，（21±3）μV]、[（186±15）ms，（7±2）μV] 和 [（104±12）ms，（14±3）μV]。证明GB能有效缓解视神经钳夹伤后引起的大鼠视功能的损伤。F-VEP结果与各组大鼠视网膜形态学改变相符合，说明腹腔注射银杏内酯B能部分抑制大鼠视神经钳夹后RGCs凋亡，具有一定的RGCs保护作用，并能部分缓解视功能的损伤。有关GB对RGCs功能的保护作用及机制将进一步深入研究。

[1] Weinmann S，Ron S，Schwarzbach C.Effects of Ginkgo biloba in dementia：systematic review and meta-analysis[J].BMC Geriatrics，2010，3（17）：10-14.

[2] 官堂明，黄家园，黄洁浩，等.银杏叶提取物防治神经系统疾病的临床研究进展[J].中国老年医学杂志，2012，11（32）：5078-5081.

[3] 朱翠萍.银杏叶治疗视网膜震荡38例疗效观察[J].中国医学创新，2011，8（6）：61-62.

[4] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.银杏苦内酯B 对体外培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（2）：791-795.

[5] 孟晶，唐仕波，林少芬，等.银杏内酯B对N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜变性的保护作用[J].眼科研究，2006，24（4）：340-343.

[6] 孟晶，丁小燕，朱晓波，等.银杏苦内酯B 对体外培养的视网膜神经细胞内钙离子浓度和线粒体功能的影响[J].中国病理生理杂志，2009，25（11）：2192-2196.

[7] Nakazawa T，Tamai M，Mori N.Brain-derived neurotrophic factor prevents axotomized retinal ganglion cell death through MAPK and PI3K signaling pathways[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（10）：3319-3326.

[8] Ma K，Xu L，Zhang H，et al.The effect of ginkgo biloba on the rat retinal ganglion cell survival in the optic nerve crush model[J].Acta Ophthalmol，2010，88（5）：553-557.

[9] Ma K，Xu L，Zhan H，et al.Dosage dependence of the effect of Ginkgo biloba on the rat retinal gangli on cell survival after optic nerve crush[J].Eye （Lond），2009，23（7）：1598-1604.

[10] Dezawa M，Kawana K，Negishi H，et al.Glial cells in degenersting and regeneranting optic nerve of the adult rat[J].Brain Res Bun，1999，48（6）：573-579.

[11] Cybulska-Heinrich A K，Mozaffarieh M，et al.Flammer Ginkgo biloba：an adjuvant therapy for progressive normal and high tension glaucoma[J].Mol Vis，2012，18（2）：390-402.

[12] Cheung Z H， Leung M C，Yip H K，et al.A neuroprotective herbal mixture inhibits caspase-3-independent apoptosis in retinal ganglion cells[J].Cell Mol Neurobiol，2008，28（1）：137-155.

[13] Yan H，Li F，Zhang L.A new and reliable animal model for optic nerve injury[J].Curr Eye Res，2012，37（10）：941-948.

[14] Huo Y，Yin X L，Ji S X，et al.Amino-Nogo inhibits optic nerve regeneration and functional recovery via the integrin αv signaling pathway in rats[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（2）：616-626.

[15] Holmes M D，Sires S B.Flash visual evoked optic neuropathy[J].Ophthalmol Plast Reconstru Surg，2004，20（5）：342-346.