TFPI-2在食管鳞癌中的表达及其临床意义*

卢建国 赵香梅 赵宝生 齐博

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，食管癌中鳞癌最常见，约占食管癌的90%。我国是全世界食管癌发病率和死亡率最高的国家。随着医学诊疗技术水平的不断提高，手术方法的不断改进，切除率显著提高，手术死亡率也大大降低，但5年生存率仍在30%~40%之间徘徊。食管癌预后差的主要原因是由于肿瘤对周围组织的侵袭，以及在肿瘤早期就发生邻近组织和远端组织的转移。TFPI-2即组织因子途径抑制物2，是一种丝氨酸蛋白酶抑制物，可抑制纤溶酶、胰蛋白酶、基质金属蛋白酶（MMPs）等多种蛋白酶活性。近年来的研究发现，TFPI-2通过抑制MMPs等多种机制，降低肿瘤的侵袭能力，在抑制肿瘤发生侵袭和转移的过程中发挥重要作用[1-3]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本实验的标本来自2009年4月-2010年7月新乡医学院第一附属医院胸外科食管鳞癌患者行根治性切除病例。选择临床病理资料完整的52例食管鳞癌病例、28例癌旁（3 cm<距肿瘤边缘<5 cm）病例为研究对象；同时选择28例食管鳞癌切除标本上、下断端（距肿瘤边缘>5 cm）的正常食管组织作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 试剂 兔抗人VEGFR-3多克隆抗体：购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司 （1：100）。兔抗人TFPI-2多克隆抗体：购自北京义翘神州生物技术有限公司（1：200）。通用型SP-9000检测试剂盒（549257A）：购自北京中杉金桥公司；3，3-二氨基对二氨基联苯（3，3-Diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（549257A）：购自北京中杉金桥公司。

1.2.2 免疫组化染色步骤（SP法）（1）切片烤片后常规二甲苯脱蜡，递减梯度酒精（无水乙醇、95%酒精、80%酒精I、II）各3 min脱蜡至水。（2）新鲜配制3%H202，于室温下避光浸泡10 min，以阻断内源性过氧化物酶。（3）PBS液洗3次，每次5 min。（4）柠檬酸缓冲液浸泡，微波修复（高火加热至沸腾后，降至低火，加热共20 min后，自然冷却至室温）。（5）PBS液洗3次，每次2 min。（6）滴加通用型的正常山羊血清工作液室温下与湿盒中封闭10 min。（7）PBS液洗3次，每次5 min。（8）滴加一抗：A兔抗人VEGFR-3多克隆抗体：购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司（1∶100）。置于湿盒中4 ℃过夜，B兔抗人TFPI-2多克隆抗体：购自北京义翘神州生物技术有限公司（1∶200），置于冰箱中4 ℃过夜。（9）PBS液洗3次，每次5 min。（10）每张切片滴加1滴（约 50 μL）二抗（1%BSA-PBS），37℃下孵育20 min。（11）应用DAB溶液显色，镜下控制染色时间。（12）自来水充分冲洗，苏木素复染。（13）梯度酒精脱水。（14）二甲苯透明、中性树胶封片。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件包，根据资料类型分别采用 字2检验、t检验、方差分析及Spearman等级相关分析进行统计学处理。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TFPI-2在食管鳞癌组织、癌旁组织和正常食管组织中表达 阳性指数=（TFPI-2阳性染色面积/视场面积）×100%。TFPI-2表达阳性指数在食管鳞癌组织、癌旁组织、正常食管组织中分别为（16.25±9.57）%、（22.41±7.24）%、（27.76±5.30）%。三组间比较，F=19.233，P=0.000；鳞癌组织与癌旁组织比较，P=0.015；鳞癌组织与正常食管组织比较，P=0.000；癌旁组织和正常食管组织比较，P=0.002。差异均具有统计学意义。

2.2 癌组织中TFPI-2的表达与各临床病理因素之间的关系 食管鳞癌中淋巴结转移、大小、浸润深度、TNM分期及肿瘤的分化程度与TFPI-2的表达阳性指数则呈负相关（rs分 别 =-0.315、-0.444、-0.647、-0.772、-0.292）。 见表1。

表1 TFPI-2与食管癌临床、病理之间的关系

3 讨论

TFPI-2，过去又叫胎盘蛋白5（placenla protein 5，PPS），基因位于人类染色体7q22，全长约7.0 kb，整个TFPI-2基因由5个外显子（由罗马数字指定）和4个内含子（由字母命名）组成。是一种相对分子量为32 kDa的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，由多种细胞合成并定向分泌到细胞外基质（ECM），它是介导或调节细胞外基质降解和重塑的质粒[1，4-5]。TFPI-2蛋白的4级结构中包含有能够抑制多种丝氨酸蛋白酶的结构元件，其反应活性部位能与多个丝氨酸蛋白酶（糜蛋白酶、纤溶酶、纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、FXa、血浆激肽释放酶及基质金属蛋白酶等）对应的活性位点结合，对这些酶的活性起到竞争性抑制作用[4]，纤溶酶及基质金属蛋白酶家族参与了ECM的降解和重塑，大量研究表明这些丝氨酸蛋白酶在肿瘤细胞的生长、浸润和转移，肿瘤组织中新生血管生长、伤口愈合、血栓的溶解吸收及等病理生理过程中发挥了重要作用[4-5]。降解是肿瘤侵袭和转移的关键一步，而TFPI-2蛋白保护ECM不被降解，维持ECM结构完整性，一些侵袭性比较强的肿瘤组织中TFPI-2的表达显著下调。Miyagi等[6]1996检出TFPI-2基因定位于染色体的7q22，7号染色体的缺失常见于多种肿瘤，包括小细胞肺癌、胃腺癌以及骨髓瘤等多种恶性肿瘤，提示TFPI-2基因的改变参与了肿瘤的演进。肿瘤组织中TFPI-2的下调也可能是TFPI-2基因序列中的CpG被甲基化后促使其基因的转录沉默而实现的[7]。TFPI-2基因还被认为是一种抑癌基因，而CpG岛是该基因调控的主要位点。Miyagi等[8]报道在九种胰腺癌细胞株中TFPI-2基因序列中的CpG甲基化发生率为77.8%。

在食管鳞癌中，基质金属蛋白酶等表达上调促进细胞外基质的降解，而TFPI-2作为基质水解酶抑制剂表达下调[9-10]。TFPI-2表达的下调可能促进食管癌鳞癌细胞恶性行为的发展。因此TFPI-2表达阳性指数在正常食管上皮、癌旁组织、癌组织中的表达指数呈递减趋势，差异极显著（P<0.05）。

TFPI-2在多种肿瘤中表达下调，与肿瘤的生长、侵袭及转移有关[11-13]，在多数肿瘤中TFPI-2表现出抑制肿瘤细胞生长、侵袭及转移的负性调节作用。食管鳞癌细胞无论是局部生长还是通过血道或者淋巴管道形成远处转移，或对周围组织侵袭，首先都要降解或破坏细胞外基质，从而导致TFPI-2表达下调[14-15]。本组实验结果显示食管鳞癌中TFPI-2的表达阳性指数明显下降，其阳性指数与食管癌淋巴结转移、浸润深度、肿瘤大小、分化程度、TNM分期呈负相关。

目前关于TFPI-2与食管鳞癌的关系少有报道，但是根据TFPI-2在细胞外基质中的作用及食管鳞癌细胞的特性，有理由相信，在食管鳞癌生长、侵袭和转移的过程中TFPI-2扮演了重要的角色，其具体作用机制是否也是TFPI-2基因序列中的CpG甲基化导致的，尚待进一步研究。本实验结果使得对食管鳞癌中TFPI-2下调机制的研究提供了可行性探索，也为改善食管鳞癌的预后和寻找新的治疗切入点提供了线索。

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