BBD法优化燕窝唾液酸水提工艺及燕窝水解物对果蝇寿命的影响

范群艳

(1.厦门市丝浓食品有限公司，福建 厦门 361101;2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)



BBD法优化燕窝唾液酸水提工艺及燕窝水解物对果蝇寿命的影响

范群艳1,2

(1.厦门市丝浓食品有限公司，福建 厦门 361101;2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

采用水提法提取燕窝唾液酸，并运用Box-Behnken设计(BBD)确定唾液酸的最优水提工艺；在果蝇培养基中添加燕窝水解物，研究其对果蝇寿命的影响.结果表明,燕窝唾液酸的最优水提工艺条件为:液料比20∶1、水提温度103 ℃、水提时间23 min，按此工艺条件得到的唾液酸提取率为(9.08±0.12)%.燕窝水解物可延长雌雄性果蝇的半数死亡时间，在果蝇培养基中添加1.2 g·L-1燕窝水解物均可延长雌雄性果蝇的寿命，寿命延长率分别达20.4%和16.8%，表明燕窝在延长果蝇存活时间方面有一定的作用.

燕窝; 唾液酸; 果蝇; 延长寿命

燕窝是雨燕科几种金丝燕分泌的唾液及其绒羽混合粘结所筑成的巢穴[1-2].燕窝的功效最早记载于清代名医张璐的《本经逢原》中，其作为药食两用的高档滋补品，深受国内外消费者的喜爱.

唾液酸又名燕窝酸，是燕窝最主要的生物活性成分，占燕窝总质量的7%-15%.唾液酸具有提高婴儿智力和记忆力、抗病毒、抗肿瘤、抗老化、抗炎症和抑制凝集等作用[3-6].

燕窝的主要食用方式为水炖煮，而水提法是常被用于食品中营养成分和天然活性成分提取的方法，该方法工艺简单、操作便捷、生产成本低[7].近几年国内外对燕窝的研究主要集中在真伪鉴别方面，对燕窝中的特征成分——唾液酸提取的研究鲜有报道.因此，本试验采用传统水提法，探讨不同水提条件对燕窝唾液酸提取率的影响，运用Box-Behnken设计(BBD)获得唾液酸水提的最佳工艺条件；并以果蝇为对象，研究在其培养基中添加燕窝水解物对果蝇寿命的影响，旨为燕窝作为抗衰老保健食品和药品的开发提供参考，也为燕窝的综合利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

燕窝原产于马来西亚，由厦门市丝浓食品有限公司提供；唾液酸标准品由Sigma公司出品；95%乙醇、氢氧化钠、硫酸铵、冰醋酸、茚三酮等试剂均为分析纯(AR).

主要仪器设备有PL602-L电子天平(梅特勒—托利多仪器上海有限公司)、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、L530离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)、THZ-82型水浴恒温震荡器(常州国华电器有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、DS-200型电动高速组织捣碎机(江苏江阴市科研器械厂)、LDZX-75KB高温高压锅(上海申安医疗器械厂)、RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂).

1.2 燕窝样品的制备

称取一定量的燕窝研磨过筛后置锥形瓶中，加入适量水浸泡1 h，调节pH，隔沸水炖煮30 min.取匀浆后的燕窝水解物10 mL，加入10 mL 50%醋酸，使用高温高压锅水解，取出后迅速冷却，将燕窝水解物定容至50 mL.

1.3 唾液酸提取率的测定

图1 唾液酸的标准曲线Fig.1 Sialic acid standard curve

唾液酸可与酸性茚三酮发生反应，形成稳定的黄色溶液，并在470 nm波长处有最大吸收峰[8].分别配制0、5、10、20、50、100和200 μg·mL-1标准唾液酸溶液，吸取1 mL，加1 mL冰醋酸和1 mL酸性茚三酮，水浴10 min，待其冷却后在470 nm波长处测定光密度(D).以唾液酸含量为横坐标，以D470 nm为纵坐标，得标准曲线(图1).

取10 mL燕窝唾液酸水解液至离心管中，加入1.25 g硫酸铵蛋白沉淀剂，搅拌至沉淀剂溶解，在3000 r·min-1高速离心机中离心10 min.取上清液1 mL，与酸性茚三酮和冰醋酸混合摇匀，在沸水浴中保温10 min，取出试管，冷却后于470 nm波长处测定D.

1.4 燕窝唾液酸水提工艺的设计

选择液料比、水提温度、水提时间和pH进行单因素试验(表1);根据单因素试验结果，选取水提时间、水提温度和料液比进行响应面试验(表2)。

表1 单因素设计因素水平

表2 响应面试验因素水平

1.5 燕窝水解物对果蝇寿命影响的试验设计

1.5.1 基础培养基的配制 称取17 g玉米粉、13 g蔗糖和1.5 g琼脂粉置500 mL烧杯中，加入170 mL蒸馏水搅拌混匀，于电磁炉上加热煮沸，待稍冷后加入1.5 g酵母粉和1 mL丙酸，充分调匀，分装[9].

1.5.2 燕窝培养基的配制 燕窝研磨过40目筛，称取0.12 g置锥形瓶中，加入20 mL水，浸泡1 h，调节pH至7，隔沸水水提30 min.取匀浆过的燕窝水解物20 mL，备用.

在果蝇的基础培养基中分别加入低剂量(0.6 g·L-1)、中剂量(1.2 g·L-1)和高剂量(1.8 g·L-1)的燕窝水解物，制得样品培养基.

1.5.3 果蝇生长情况的观察 收集在8-10 h内未交配羽化的果蝇，乙醚麻醉后平铺于纸上鉴别雌雄.选取雌雄各半，随机分为4组，每组50只，每天定时观察并记录对照组(饲喂基础培养基)和各燕窝剂量组(饲喂燕窝培养基)果蝇的存活数、死亡数，直至全部死亡为止.果蝇的培养基每3天更换1次.

半数死亡时间：每组有一半数量果蝇死亡的天数即为半数死亡时间；寿命延长率/%=(试验组平均寿命-对照组平均寿命)/对照组平均寿命×100；生长曲线：以寿命为横坐标，存活率为纵坐标记录果蝇生长情况的曲线.

1.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 燕窝唾液酸水提工艺单因素试验结果

2.1.1 料液比对唾液酸提取率的影响 由图2可知，燕窝唾液酸的提取率随着液料比的增大呈上升趋势，在液料比为20∶1时达到最大值，而后趋于平缓.

2.1.2 水提温度对唾液酸提取率的影响 由图3可知，燕窝唾液酸的提取率随着水提温度的升高呈缓慢上升趋势，在温度达到100 ℃时达到最大值，但温度继续升高时提取率略有下降，这可能是由于温度过高，在一定程度上破坏了唾液酸的成分.

图2 料液比对唾液酸提取率的影响

2.1.3 水提时间对唾液酸提取率的影响 由图4可知，水提开始时，燕窝唾液酸的提取率随着水提时间的延长而升高，水提时间为20 min时达到最大值，之后随着水提时间的继续延长，提取率不再升高反而略有下降.受热时间过长会破坏唾液酸的成分.因此，水提时间以20 min为最佳.

2.1.4 pH对唾液酸提取率的影响 唾液酸在人体组织中基本以结合态的形式与黏多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖链相连[10]，偏酸或偏碱条件可能会破坏唾液酸的结构，不利于唾液酸的提取.由图5可知，随着pH的升高，燕窝唾液酸的提取率呈先上升后下降的趋势，在pH为7时达到最大值.

图4 水提时间对唾液酸提取率的影响

2.2 燕窝唾液酸水提工艺优化试验结果

2.2.1 BBD响应面试验结果 在单因素试验的基础上，以水提时间(A)、水提温度(B)和料液比(C)为试验因素，唾液酸提取率(Y)为指标进行BBD响应面试验，结果如表3、4所示.

表3 BBD响应面试验设计及试验结果

表4 回归模型方差分析

从表4可以看出:该模型的一次项A、B均极显著，C显著，二次项A2、B2、C2及交互项AC、BC极显著;所选用的试验模型组的P为0.0003，表明回归模型极显著(P≤0.01);失拟项为0.576，表明模型组的纯误差并不显著，可以用来分析和预测燕窝水提工艺的最佳条件.

利用Design Expert 7.0软件对表3的数据进行分析，得燕窝唾液酸提取率(Y)与水提时间(A)、水提温度(B)和液料比(C)交互关系的二次多项回归方程为：Y=9.040-0.160A+0.160B-0.061C+0.038AB+0.087AC+0.180BC-0.240A2-0.560B2-0.570C2.对该方程中的各因素求解一阶导数，得到最佳的提取工艺条件为：液料比19.39∶1、水提温度102.53 ℃、水提时间为22.64 min.在此工艺条件下，唾液酸提取率的预测值为9.28%.

从图6-8可以看出，各因素间的交互作用显著.水提温度为100-105 ℃时，唾液酸的提取率随着水提时间的延长显著提高；料液比为15∶1-20∶1时，提取率随着水提时间和水提温度的上升而不断提高；水提时间为20-25 min时，随着水提温度的上升，提取率变化显著.

2.2.2 验证试验结果 为进一步验证最佳响应点的值，进行验证性试验.根据实际情况将工艺条件调整为：液料比20∶1、水提温度103 ℃、水提时间23 min，在此工艺条件下，唾液酸的提取率为(9.08±0.12)%，与理论预测值接近，精准率达97.84%，证明该响应面模型所得方程能较准确地反应各因素对唾液酸提取率的影响.

图6 水提时间与水提温度对唾液酸提取率的等高线图与响应面图

图7 水提时间与料液比对唾液酸提取率的等高线图与响应面图

图8 水提温度与液料比对唾液酸提取率的等高线图与响应面图

2.3 燕窝水解物对果蝇寿命的影响

2.3.1 对果蝇存活时间的影响 动物体的衰老是一个极其复杂的过程，寿命是衡量衰老的一个最重要指标[11].果蝇自然生命周期较短，在25 ℃的适宜环境下，从卵、幼虫、蛹到成虫不过10 d，成虫的自然寿命也只有50-60 d.由于果蝇体形小，可以采用较多样本做试验，从而减少了抽样误差，因而果蝇常被作为延缓衰老试验的研究对象.

从表5可见：各燕窝剂量组雌雄性果蝇的半数死亡时间均长于对照组，其中，中剂量组雌雄性果蝇的半数死亡时间分别达59和52 d；低、中、高剂量组雄性果蝇的寿命延长率分别为12.7%、16.8%和11.9%，雌性果蝇分别为15.5%、20.4%和13.0%.雌性果蝇的寿命均长于雄性果蝇，这与雌雄性果蝇的个体差异有关，但具体机制尚待进一步研究.

表5 燕窝水解物对果蝇存活时间的影响

2.3.2 对果蝇生长曲线的影响 从果蝇生长曲线(图9、10)可以看出，与对照组相比，各燕窝剂量组雌雄性果蝇的生长曲线均出现右移，中低剂量组与高剂量组的生长曲线较为相似.进一步揭示了燕窝在延长果蝇存活时间方面有一定的作用.

图9 雄性果蝇的生长曲线

3 结论

本试验研究了传统水提工艺各因素对燕窝唾液酸提取率的影响，采用BBD法得到最优的水提工艺条件为：液料比20∶1、水提温度103 ℃、水提时间23 min.在此工艺条件下，唾液酸的提取率可达(9.08±0.12)%.

在果蝇的基础培养基中添加燕窝水解物饲喂果蝇，可延长果蝇的寿命，且中剂量组果蝇的半数死亡时间、寿命延长率均最高，雌雄性果蝇的寿命延长率分别达20.4%和16.8%，表明燕窝具有一定的延缓衰老作用，其影响机理需进一步研究.

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(责任编辑:施晓棠)

Optimum process conditions of birds nest sialic acid by aqueous extraction and the effects on extending the lifespan of drosophila

FAN Qun-yan1,2

(1.Xiamen Seelong Food Co. Ltd., Xiamen, Fujian 361101, China; 2.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

The aqueous extraction process of birds nest sialic acid and the effect of sialic acid on drosophila life were verified. The results showed that the experimental sialic acid yield of (9.08±0.12)% was achieved under the conditions of solid-liquid ratio 20∶1, temperature 103 ℃, time 23 min, and pH 7. Compared to the control group, each test group of drosophila had longer mean time to death. Medium dose groups extended the life of the female and male drosophila to 20.4% and 16.8% respectively. It suggests that bird nest sialic acid has the function of anti-aging.

birds nest; sialic acid; vinegar fly; extend the lifetime

2014-07-26

2014-09-19

厦门市科技计划项目(3502Z20141070).

范群艳(1981-)，男，硕士研究生.研究方向：食品科学.Email:fanqunyan729@126.com.

R284.2

A

1671-5470(2015)04-0424-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.016