电针对PCPA致失眠大鼠脾脏TLR7信号通路关键基因m RNA表达的影响

何华香， 赵仓焕， 陆 雪， 陈孝银， 林炎龙

（暨南大学1.医学院中医系，广东广州510632；2.附属第一医院针灸科，广东广州510630）

电针对PCPA致失眠大鼠脾脏TLR7信号通路关键基因m RNA表达的影响

何华香1， 赵仓焕2， 陆 雪1， 陈孝银1， 林炎龙2

（暨南大学1.医学院中医系，广东广州510632；2.附属第一医院针灸科，广东广州510630）

目的：观察电针对对氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠脾脏Toll样受体7（TLR7）信号通路关键基因mRNA表达的影响，探讨电针治疗失眠的免疫学机制.方法：取健康SPF级Wistar雄性大鼠32只，随机分成空白组、模型组、电针组和安定组，每组8只.模型组以腹腔注射PCPA建立大鼠失眠模型，安定组给予腹腔注射安定，电针组给予电针神门（HT7）、三阴交（SP6）穴位，连续治疗5 d后用实时荧光定量PCR（RT-PCR）反应测定大鼠脾脏TLR7、髓样分化蛋白88（MyD88），IL-1受体相关激酶4（IRAK4）、肿瘤坏死因子相关激酶6（TRAF6）、及核因子NF-κB（NF-κB）的mRNA表达.结果：与空白组对照，模型组TLR7、MyD88、IRAK4及TRAF6的mRNA表达增加（P＜0.05）；与模型组比较，电针组、安定组IRAK4、TRAF6及NF-kB的mRNA表达降低，电针组TLR7及MyD88的mRNA表达降低（P＜0.05），但电针组与安定组比较，无统计学差异（P＞0.05）.结论：失眠上调TLR7信号转导通路关键基因mRNA表达，TLR7可能参与免疫对睡眠的调节；电针可通过调节TLR7信号转导通路调控相关免疫物质的释放，改善睡眠及减轻失眠对机体带来的损伤.

电针； 神门； 三阴交； PCPA； 失眠； TLR7； RT-PCR

传统中医学认为，失眠是各种原因所致脏腑机能紊乱，气血阴阳失调，阳盛阴衰，阳不入阴以致心神不安所引起的.针灸是治疗失眠重要的非药物方法，临床报道是安全有效的［1］.失眠的病因及发病机制复杂，与脑内神经递质及免疫系统释放的细胞因子有关.有实验研究表明针灸治疗有镇静催眠的效果，其机制可能通过调节紊乱的免疫细胞因子来调节睡眠觉醒周期、改善睡眠［2－3］，同时针灸还可提高胸腺指数、脾脏指数、血白细胞数，增强脑组织超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性从而延缓免疫器官萎缩、增强免疫功能［4］.有研究发现耳穴贴压可调理Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）信号转导通路基因的表达，改善机体免疫功能，间接改善睡眠［5］.本实验拟以PCPA法制作睡眠剥夺大鼠模型，通过电针神门（HT7）、三阴交（SP6）穴治疗，再用RT-PCR方法检测脾脏TLR7信号通路关键基因7（Toll-like receptor 7，TLR7）、Myeloid differentiation factor 88（MyD88）、磷酸化IL-1受体相关激酶4（IL-1 receptor-assoiated kinase 4，IRAK4）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF-Receptor-assoiated factor 6，TRAF6）及NF-κB mRNA表达，来研究电针治疗失眠的免疫学机制，为临床电针治疗失眠症提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

（1）实验动物 健康SPF级Wistar大鼠，雄性，32只，体质量220～250 g.由中山大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK＜粤＞2011-0029，动物合格证号：NO.44008500002334.

（2）主要试剂与仪器 PCPAG购自Sigma公司，批号：SHBC7961V；安定注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，批号：1210181；SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、TIANGEN，No.L0802、批号为130101穗鑫牌针灸针购自苏州市华伦医疗用品有限公司；KWD-808脉冲电疗仪为常州市武进长城医疗器械有限公司产品.

1.2 方法

（1）动物分组与造模 取健康SPF级Wistar雄性大鼠32只，按体质量编号，按随机数字表法随机分成空白对照组、模型组、电针组和安定组，每组8只.

PCPA法造模：按文献［6］，临用前将弱碱性生理盐水把PCPA粉末配置成悬混液，按质量分数为300 mg／kg量腹腔注射，每日1次，连续2 d.在第1次腹腔注射PCPA28～30 h后，大鼠出现昼夜节律消失，而对照组正常，表明模型复制成功.

（2）动物处理 空白对照组：不予任何处理.模型组：造模后不予处理.电针组：造模成功后于次日上午8：30分即实验第3天用鼠板及自制鼠袋固定大鼠并给予电针双侧神门、三阴交穴位，输出波型为连续波密波（同频80次／s），刺激量以穴位局部肌肉跳动为标准，每次20 min，每日1次，连续5 d.穴位定位参考《实验针灸学》［7］“神门”：前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，“三阴交”：后肢内踝尖上10 mm.安定组给予腹腔注射安定注射液，按人鼠给药剂量体表面积折算公式计算出治疗质量分数为0.92 mg／kg，每日1次，连续5 d.

（3）标本采集、观察指标及引物设计 标本采集：麻醉状态下无菌操作取出脾脏，吸去脾脏表面液体，除去脂肪、系膜，放入－80℃冰箱保存.

观察指标：脾脏TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6、NF-κB的mRNA表达.采用RT-PCR，检测每个标本均设复孔，重复3次，获得TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6及NF-κB mRNA基因CT值后，以β-actin为内参照，用2－ΔΔCT法计算各基因的相对表达量.

引物设计：在Genebank里查找大鼠基因序列号（TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6与NF-κB），由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物，内参基因为β-actin（表1）.

表1 应用于RT-PCR的引物序列及产物大小Table 1 The primers sequences and the size of products used in Rt-PCR

1.3 统计学处理

采用统计软件SPSS 17.0进行统计学描述和分析，所有数据采用（均数±标准差）（±s）表示.用Levene's进行方差齐性检验，多组计量资料组间差异采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA），方差齐者用SNK法，方差不齐者用Tamhane's T2法进行统计分析，以P＜0.05有统计学差异.

2 结果

2.1 大鼠一般活动及体征变化

适应期间，所有的大鼠皮毛顺泽，精神状态良好，饮食及二便正常，昼夜节律正常.在第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出现易受声光等激扰而狂躁不安，不让抓握，白天夜晚活动不停，睡眠－觉醒周期紊乱.电针组及安定组大鼠经治疗后，昼夜节律恢复较快，白天较安静倦卧，睡意明显但易惊醒，行为活动趋于正常，皮毛顺滑，饮食及二便正常；而模型组大鼠皮毛蓬松枯槁，眼眶周围发黑，饮食减少，昼夜节律恢复较慢.

2.2 RT-PCR扩增曲线

对TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6与NF-κB基因分别进行RT-PCR检测，结果显示各目的基因扩增效率高（图1），特异性强（图2）.

图1 各目的基因RT-PCR扩增曲线图Fig.1 The RT-PCR amplification curve of each target gene

2.3 RT-PCR结果

与空白组对照，模型组TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6及NF-κB的mRNA表达增加（P＜0.05）；与模型组比较，电针组、安定组IRAK4、TRAF6及NF-κB的mRNA表达降低（P＜0.05），但电针组与安定组比较，无统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，电针组TLR7、MyD88的mRNA表达降低（P＜0.05），但电针组与安定组比较，无统计学差异（P＞0.05，表2）.

图2 各目的基因RT-PCR溶解曲线图Fig.2 The RT-PCR dissociation curve of each target gene

表2 各组大鼠脾脏TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6与NF-κB的mRNA表达比较（±s）Table 2 The comparisions of TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6 and NF-κB m RNAs levels in the spleen of rats growps

表2 各组大鼠脾脏TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6与NF-κB的mRNA表达比较（±s）Table 2 The comparisions of TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6 and NF-κB m RNAs levels in the spleen of rats growps

1）与对照组相比较，P＜0.05；2）与模型组相比较，P＜0.05.

mRNA空白组组别 n／只 TLR7 mRNA MyD88 mRNA IRAK4 mRNA TRAF6 mRNA NF-kB 6 1 1 1 1 1模型组 6 2.07±0.921） 1.43±0.271） 1.41±0.271） 2.31±0.811） 2.99±1.691）电针组 6 0.82±0.162） 1.04±0.202） 1.03±0.252） 0.92±0.372） 1.15±0.392）安定组 6 1.19±0.55 1.23±0.23 1.03±0.202） 0.99±0.402） 1.19±0.652）

3 讨论

TRL7是一种TooL样受体，为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，在抗感染及自身免疫方面发挥重要作用.TLR7主要在肺、脾脏、胎盘等组织中表达，由免疫细胞表达.TLR7在细胞内的信号转导是MyD88依赖的信号通路，并有研究表明MyD88基因敲除则应答TLR7配体时，不能激活鼠来源的树突状细胞（Dendritic cells，DC）和巨噬细胞中NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路产生炎性细胞因子［8］.MyD88依赖的信号通路是多种TOLL样受体的的共同通路，涉及多种信号蛋白，研究较清楚的下游信号分子主要有MyD88、IRAK4、TRAF6与NF-κB.相应配体与TLR7结合活化，通过接头分子MyD88招募IRAK4，IRAK4活化后可磷酸化IL-1受体相关激酶1（IL－1 receptor-associated kinase，IRAK1），磷酸化的IRAK1与TRAF6相结合，TRAF6活化后使TGF-β活化的激酶（TGF-activated kinase 1，TAK1）活化，进而通过IκB激酶级联反应，使转录因子NF-κB活化，启动相关靶基因转录，诱导免疫细胞分泌促炎症细胞因子和趋化因子如白细胞介素1（Interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素12（Interleukin-12，IL-12）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等［9］并激活干扰素调节因子5、7（Interferon regulatory factor 5、7，IRF5、IRF7），诱导Ⅰ型干扰素的分泌［10］.这些细胞因子作为一种信号语言，既可参与免疫调节、发挥免疫效应，还能促进睡眠，对生理性睡眠起重要的调节功能［11］.

通过本实验观察到，失眠大鼠脾脏TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6及NF-κB的mRNA表达上调，说明短期失眠激活了大鼠的TLR7信号通路，引起炎症因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等分泌的增加，与吴兴曲等［12］研究短期睡眠剥夺使大鼠血清细胞因子IL-6和TNF-α含量升高是相符的，急性睡眠反应或睡眠剥夺后“反跳”现象可能与此相关，TLR7信号通路参与了免疫对睡眠的调节.短期失眠引起TLR7信号通路的活化、表达，一方面可介导引起炎症反应，但过度表达也会引起人体免疫系统功能的伤害，使机体免疫力下降及诱发和促进自身免疫性疾病的发生和发展［13］.有研究发现失眠会使部分免疫球蛋白、补体和部分T淋巴细胞亚群下降［14］，而睡眠质量越差，对免疫系统功能影响就越大［15］.而慢性睡眠障碍对免疫功能具有明显抑制作用，包括CD3、CD4、CD8T细胞数减少，IL-2分泌下降和TNF-α分泌量升高，自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）杀伤功能下降，脾重减轻，抗BSA特异性抗体分泌量下降［16］.由此，据时间的长短，失眠会给免疫系统带来不同的影响.通过电针治疗后，大鼠上述各关键基因表达都下调，说明电针治疗后的大鼠睡眠改善，而TLR7表达亦有所恢复，即睡眠的恢复伴随着免疫功能的恢复.电针也可能是能过调节TLR7信号通路影响机体相关免疫物质的释放，从而改善睡眠及减轻失眠对机体免疫系统的伤害.

由此，电针组与安定组无明显差异性，但临床上电针较安定副作用少.睡眠与免疫系统之间的关系密切复杂，其相互作用机制目前还没有完全明确阐释，可能存在很多调节网络通道，而电针治疗失眠也可能存在着多种渠道，需要更进一步的研究.

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［责任编辑：朱颖嫄］

Effects of electroacupuncture on the expression of key m RNA related to TLR7 signaling pathway in the spleen of insomnia rats induced by PACA

HE Huaxiang1， ZHAO Canghuan2， LU Xue1， CHEN Xiaoyin1， LIN Yanlong2
（Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Department of Acu-moxibustion，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China）

Aim：The objective is to observe the effects of electroacupuncture on the expression of the key genes related to TLR7 signaling pathway in the spleen of insomnia rats induced by PCPA，and to investigate the immunologic mechanism of electroacupuncture in treatment of insomnia.Methods：Thirty two healthy Wistar rats were randomly divided into four groups：bland group，model group，electroacupuncture group and diazepam group，with 8 rats in each one.The insomnia rats in themodel group were established by intraperitoneal injection of para-chlorophenylalanine（PCPA）.The rats of electroacupuncture group were treated with electroacupuncture at Shenmen and Sanyinjiao.The rats of diazepam group were treated with diazepam via peritoneal injection.The levels of TLR7，MyD88，IRAK4，TRAF6 andNF-κB mRNAs related to TLR7 signaling pathway in the spleen were determined by RT-PCR after continuous treatment for 5 days.Results：Compared with the bland group，the expressions of TLR7，MyD88，IRAK4，TRAF6 and NF-κB mRNAs were found to be increased（P＜0.05）in the model group；when compared with themodel group，expressions of IRAK4，TRAF6 and NF-κB mRNAswere decreased（P＜0.05）in the electroacupuncture and diazepam groups，while expressions of TLR7 and MyD88 mRNAs were decreased（P＜0.05）only in the electroacupuncture group.However，no significant differencewas found between these two groups（P＞0.05）.Conclusion：Insomnia could increase expression of themRNAs related to TLR7 signaling pathways，TLR7 may be involved in the regulation of sleep by the immune system；electroacupuncture might improve sleep and relieve insomnia damages to the body by adjusting the release of immune-related substances which were regulated by TLR7 signal transduction.

electroacupuncture；Shenmen；Sanyinjiao；PCPA；insomnia；TLR7；RT-PCR

A

1000－9965（2015）02－0155－05

10.11778／j.jdxb.2015.02.012

2014－11－11

广东省自然科学基金项目（S2013010013434）

何华香（1982－），女，研究方向：针刺治疗神经系统疾病

赵仓焕（1962－），男，主任医师，博士，硕士生导师，Tel：020－38688119；E-mail：tzch＠jnu.edu.cn