革兰氏阴性细菌外膜蛋白耐药功能及其抑菌策略研究进展
2015-04-17李碗芯孙莉娜林向民
李碗芯,孙莉娜,林向民
(1.福建省农业生态过程与安全监控重点实验室(福建农林大学);2.福建省高校作物生态与分子生理学重点实验室 ,福建福州350002)
革兰氏阴性细菌外膜蛋白耐药功能及其抑菌策略研究进展
李碗芯1 ,2,孙莉娜1 ,2,林向民1 ,2
(1.福建省农业生态过程与安全监控重点实验室(福建农林大学);2.福建省高校作物生态与分子生理学重点实验室 ,福建福州350002)
当前细菌耐药的形势日益严峻 ,已引起全世界的广泛关注.革兰氏阴性细菌的耐药性普遍比革兰氏阳性细菌强 ,这与镶嵌或锚定在革兰氏阴性细菌外膜上的蛋白耐药功能密切相关.目前已知外膜蛋白能够阻碍抗生素通过外膜以及将抗生素排出胞外等方式使细菌产生耐药性 ,但具体的耐药与调控机制还有待进一步研究.近年来 ,随着现代科学技术的不断发展 ,特别是结构生物学、分子生物学与蛋白质组学在该领域的充分运用 ,有关外膜蛋白功能的研究和技术取得了很大的进步.本文对近年来国内外在细菌外膜蛋白的结构与耐药机理、耐药新功能及新机制等方面的研究进展进行了概述 ,为揭示革兰氏阴性菌耐药形成机制奠定基础.
外膜蛋白;耐药机制;药物主动转运系统;抑菌策略
由于抗生素的误用与滥用 ,细菌的耐药性正逐渐成为制约世界卫生健康和经济发展的重要因素之一 ,这受到国内外研究学者的广泛关注.从1983年至1987年 ,美国食品药品监督管理局(Food and Drug Ad-ministration ,FDA)共批准16种抗生素上市 ,而1998年至2002年仅批准7种 ,2008年至2012年只批准了2种 ,抗生素的研发明显慢于耐药细菌产生的速度.2013年McKenna[1]报道 ,碳青霉烯类抗生素曾被认为是人类抵抗耐药菌的最后一道防线 ,但目前已在全世界范围内发现了针对此抗生素的超级耐药菌株.因此 ,细菌耐药机制的研究与新型药物作用靶点的筛选迫在眉睫 ,其已成为新型抗生素开发的重要研究领域 ,是当今科学研究的热点问题.
革兰氏阴性细菌的耐药性能普遍比革兰氏阳性细菌强 ,其中一个很重要的原因在于革兰氏阴性细菌多了一层外膜 ,外膜上的蛋白具有控制营养物质或如抗生素等小分子进出的功能 ,称之为外膜蛋白(outer membrane protein ,OMP).除了部分锚定在外膜内部或外部的脂蛋白以外 ,大部分外膜蛋白均由8-22个跨膜链 ,以反向平行方式通过相邻链间的氢键作用形成β-桶状结构(β-barrel).跨膜链的数量决定了外膜蛋白的拓扑结构 ,从而导致孔径的不同[2].如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的OmpA、OmpF、TolC和OmpW等蛋白的结构与功能具有代表性和特殊性.Nikaido et al[3]认为 ,外膜蛋白可以通过启动细菌主动药物转运系统(efflux pump systems)和改变细胞外膜的通透性而诱导细菌耐药特性的形成.
1 外膜蛋白的结构与耐药功能
1.1 细菌主动药物转运系统
主动药物转运系统又称外排(efflux) ,可以通过外膜蛋白与周质空间蛋白和内膜蛋白组成的复合物系统 ,将抗菌药物泵出细胞外.在目前已知的与抗生素抗性有关的外膜蛋白中 ,TolC是一个广泛报道的参与外排广谱性抗生素药物的多功能外膜蛋白.1996年Nikaido[4]和Fralick[5]几乎同时发现TolC与周质空间蛋白ArcA和内膜蛋白ArcB形成的复合物具有重要的多重药物外排功能;随后在产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)等革兰氏阴性细菌中相继发现 ,TolC的同源蛋白也具有外排抗生素的功能[6-7],形成如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的MexA-MexB-OprM和MexC-MexD-OprJ、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的VmeA-VmeB-TolC等复合物 ,统称为多重耐药外排系统[8].
结构生物学研究显示 ,TolC可形成特殊的三聚体结构 ,3个亚基在外膜处由12条β折叠链共同组成一个β-桶状结构 ,并在周质空间处由12个α-螺旋形成内空的通道[9].TolC长桶状的结构使其容易在Ar-cA的协助下与AcrB结合 ,形成连接细胞内外物质运输的特殊通道 ,在质子动力势的作用下将抗生素排出胞外[10-11].此外 ,TolC可以与主要易化子(major facilitator superfamily ,MFS)家族和ABC超家族(ATP bind-ing casssette superfamily)相互作用.目前已知的与抗生素抗性相关的大肠埃希氏菌外膜蛋白复合物 ,大部分与TolC相关 ,包括AcrAB、AcrAD、AcrEF、MdtEF、MdtABC和MacAB等系统[5 ,12-14],可以外排如疏水性溶剂以及β-内酰胺类、萘啶酮酸和氨基糖苷类等多种抗生素.由于TolC蛋白在细菌耐药中的重要作用 ,缺失tolC基因的菌株对广谱性抗生素的敏感性显著下降[15].
1.2 改变细胞外膜的通透性
从20世纪90年代至今 ,研究人员从蛋白的结构、功能以及基因组序列预测等方面对涉及泵外排系统的外膜蛋白进行了系统的研究 ,并取得重大进展.但多数研究集中在外膜蛋白空间结构和孔径大小与抗生素的相互作用方面 ,有关这些蛋白的耐药功能与调控机制的研究并不多.研究比较透彻的涉及抗生素摄取的外膜蛋白为OmpC和OmpF超家族 ,这是大肠埃希氏菌细胞外膜上的2个主要孔道蛋白 ,对一定大小的亲水性小分子物质具有非特异通道的属性.这2个蛋白具有很高的同源性 ,结构和功能也相似.但是通过对多种不同分子大小的有机分子的渗透率的研究发现 ,OmpF的孔道半径比OmpC至少大6倍 ,使得β-内酰胺类抗生素、胆酸等有毒物质更易从OmpF的通道通过;而OmpC可以允许分子质量小于600 u的亲水性溶质或离子通过[16].这2个外膜蛋白对不同抗生素有不同的敏感性 ,ompF基因缺失可显著增强菌株对氟诺沙星、四环素、头孢菌素、先锋霉素、氨苄青霉素和头孢西丁的耐药性 ,轻微提高对氯霉素的耐药性;ompC缺失则可增强菌株对头孢菌素和头孢西丁的耐药性 ,而对氟诺沙星、氯霉素和四环素不敏感[17-18].但是 ,OmpC与OmpF并不仅是简单的抗生素通道 ,细菌还可以根据外界环境的变化 ,调节其表达以维持外膜通透性的动态平衡.例如 ,在高渗透压或高温环境下 ,OmpC表达升高 ,而OmpF表达降低 ,从而减少分子质量相对大的溶质分子进入细胞[19].深入研究发现 ,这一对外膜蛋白受细菌双调节系统(two-component regulatory sys-tem ,TCS)OmpR/EnvZ和CpxR/CpxA的综合调控.Lin et al[20]发现 ,这2对双调节系统在金霉素和萘啶酮酸抗生素刺激下 ,OmpC和OmpF的表达呈现不同的调节模式.其中 ,在金霉素作用下 ,双调节系统综合调控导致OmpC和OmpF的表达均降低;在萘啶酮酸作用下 ,OmpC表达明显升高 ,而OmpF表达降低.
除了OmpC和OmpF家族蛋白 ,还有一些外膜蛋白参与了细菌对抗生素摄入的控制 ,如结核杆菌(My-cobacterium tuberculosis)的CpnT以及铜绿假单胞菌的OprD等 ,但在这些方面的研究相对较少[21-22].
1.3 新耐药相关外膜蛋白的发现
细菌外膜蛋白可以通过增加抗生素的外排和减少抗生素的进入使细菌产生耐药特性 ,但有关外膜耐药蛋白的种类、功能和特点还需要深入系统的研究.以大肠埃希氏菌为例 ,外膜蛋白的基因注释至少有82个 ,而目前报道具有耐药功能的却不多 ,这与有些外膜蛋白属于低丰度蛋白或只在特定条件下表达等因素有关;此外 ,抗生素的不同抑菌机制也对研究造成了一定难度.
运用定量蛋白质组学技术研究细菌耐药机制 ,使大规模寻找抗生素作用靶点和耐药功能蛋白成为可能.我国学者利用基于2DE的外膜蛋白亚蛋白质组学技术对耐不同抗生素细菌的外膜蛋白功能进行了系统的研究 ,发现在大肠埃希氏菌中 ,除了TolC、YhiU、OmpC和OmpF等常见耐药功能蛋白以外 ,FimD、OmpT、Tsx、YfiO、OmpW、LamB、NlpB和FadL等多个外膜蛋白也与钠啶酮酸、链霉素、金霉素、氨苄青霉素和四环素的耐药性相关[23-25].Peng et al[26]对抗氨苄青霉素、卡那霉素和四环素的铜绿假单胞菌外膜蛋白组分进行比较 ,发现了11个耐药相关外膜蛋白 ,其中10个外膜蛋白为以往报道.此外 ,国内外学者还运用蛋白质组学方法鉴定了如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的OmpU、OmpN、VPA1644和VPA0526 ,鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的OmpA、CarO和OmpW等耐药相关外膜蛋白[27-28].
1.4 外膜蛋白的其他耐药功能
外膜及外膜蛋白常常被形容为进出革兰氏阴性细菌的一扇“门” ,通过进入和外排系统使细菌产生耐药性.然而 ,近年来学者们发现外膜蛋白还可能存在其他的耐药途径.Lin et al[23]对外膜蛋白LamB的耐药功能进行了深入研究 ,发现大肠埃希氏菌的外膜蛋白LamB在耐药菌株中的表达普遍下调 ,缺失lamB导致金霉素在细胞内积聚 ,菌株耐药性升高4倍以上 ,其补救菌株可恢复到野生菌株的耐药能力.报道显示 ,LamB除了是抗生素的非特异通道外 ,还可能介导一个重要的负调耐药机制 ,该蛋白有可能与其他蛋白相互作用而行使耐药功能.Lin et al[29]通过免疫共沉淀及免疫印迹方法 ,成功发现了一个LamB的复合物蛋白Odp1.该蛋白是丙酮酸脱氢酶复合体E1的组成部分 ,在调控糖酵解、TCA循环以及ATP生成等体内重要生化代谢途径中起限速酶的作用.在利用iTRAQ定量标记研究大肠埃希菌应对金霉素以及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)应对土霉素应激时 ,也发现LamB相关蛋白、Odp1以及能量生成相关基因表达下降的现象 ,进一步证实LamB在耐药中的负调作用可能普遍存在于自然进化的耐药菌中 ,且具有多物种、多重耐药的特性[30-31].前人研究结果说明LamB是细菌体内的耐药关键蛋白.其与Odp1相互作用 ,很可能通过限制糖类进入细胞并参与能量代谢效应的负调控 ,降低细菌体内的能量代谢与NADH浓度 ,最终导致细菌耐药.
综上所述 ,外膜蛋白除了改变细胞外膜的通透性和启动主动药物转运系统以外 ,还可能有很多新的耐药功能等待探索.
2 蛋白相互作用平衡网络
由于抑制TolC、OmpC及OmpF等外膜蛋白耐药作用的新药物不断出现 ,人们一度认为抗生素耐药的问题已得到解决 ,但事实并非如此.研究发现 ,即使是缺失tolC基因的菌株 ,在亚致死抗生素浓度下传代培养一定代数后 ,又可以迅速获得药物抗性.Li et al[25]对该现象进行了系统的分析 ,发现细菌在耐药过程中 ,并不只是几个外膜蛋白发生了变化 ,而是形成了蛋白相互作用的动态平衡网络 ,即当一个重要外膜蛋白被抑制后 ,细菌为了生存 ,将调节外膜上的其他蛋白表达 ,形成一个耐药相关外膜蛋白相互作用网络 ,最终导致细菌耐药.例如 ,在缺失tolC的大肠杆菌耐链霉素菌株中 ,OmpW和Dps表达升高 ,而OmpT和LamB表达下降;而在缺失lamB的耐药菌株中 ,OmpW表达上升 ,FadL、OmpT和Dps表达均下降.由此表明 ,研究这些耐药相关外膜蛋白在不同抗生素中的变化方式、相互作用网络及其复杂的调控机制 ,对深入阐明细菌的耐药新机制具有重要意义.
3 外膜蛋白抑制细菌耐药策略
面对当前严峻的细菌耐药形势 ,旧抗生素和同类型抗生素已达不到抑菌的效果 ,人们亟需开发新型抑菌机制的药物.鉴于细菌外膜蛋白在耐药中的重要作用 ,近年来开发了以多种外膜蛋白为药物靶点的抗耐药菌药物.
3.1 增强细菌外膜蛋白通透性的药物
研究证实 ,许多药物在还未进入细菌内部就被细菌外膜蛋白通道挡在作用靶点之外 ,一些诸如多黏菌素、氨基糖苷类和大环内酯类的抗生素可以通过增加外膜蛋白的通透性达到抗菌作用.一些小分子物质也具有类似功能 ,如精胺可以抑制大肠杆菌OmpF的通道 ,尸胺通过抑制离子通道降低细菌对氨苄青霉素和头孢菌素Ⅱ的耐药性[32-33].
3.2 抑制细菌外排泵功能的药物
近年来发展了一系列抑制外排泵功能的药物.根据其作用机理分为以下几类.
(1)干扰外排泵组装的抑制剂.外排泵系统一般由外膜、质膜和周质空间蛋白复合物组成.抑制外排泵上相关蛋白的合成或占据其功能位点 ,外排系统就无法行使其功能.例如 ,Globomycin可以抑制结核杆菌AcrAB-TolC中AcrA前体的形成 ,从而阻断了外排泵的功能[34].
(2)阻断外排泵能量来源的抑制剂.除ABC型外排泵是依赖ATP水解驱动外 ,其余外排泵系统均是由质子动力势驱动 ,因此破坏质子动力势的来源可以使外排系统崩溃.羰基氰化氯苯腙(CCCP)可以破坏跨膜电化学梯度 ,是体外试验常用的强电子解偶联剂 ,对NepAB、EmrAB、MexAB、AcrAB以及SdeAB等复合物均有抑制作用[35-36].但是由于其副作用较强 ,临床上选用与其作用机制相同且毒性较小的奥美拉唑(omeprazole)和兰索拉唑(lansoprazole)为质子泵抑制剂[37].
(3)直接抑制或竞争外排泵系统的抑制剂.苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(PAβN)是常见的广谱性外排泵抑制剂 ,其可以与抗生素竞争RND家族外排泵 ,使抗生素集聚在细胞内 ,达到杀菌效果.此类抑制剂还包括抑制铜绿假单胞菌AcrB和MexB的MC-207、110及其衍生物 ,以及抑制产气肠杆菌等细菌AcrAB的喹啉衍生物等[38-39].
(4)抑制药物特异外排泵的药物.Tet泵是由质粒编码 ,表达在细菌膜上的特异外排泵.研究发现 ,13-CPTC是米诺环素衍生物 ,可以与四环素竞争结合Tet外排泵 ,并堵塞该泵 ,从而提高四环素在胞内的浓度[40].
(5)特异性抗体抑制外排泵的药物.如上所述 ,革兰氏阴性细菌的外膜蛋白是细菌多重耐药系统的重要组成部分 ,如果以该蛋白作为靶点 ,利用特异性抗体与靶点的结合 ,可对耐药细菌起到明显的抑制作用. Li et al[25]研究发现 ,当TolC抗体靶向耐链霉素或氯霉素的大肠埃希菌外膜TolC后 ,明显提高了细菌对抗生素的敏感性 ,与缺失该蛋白的表现结果相似.以上研究说明 ,特异外膜蛋白靶点的抗体配合低浓度抗生素可以有效抑制耐药菌 ,是一种潜在的抑菌药物 ,具有广阔的应用前景.
(6)适配体靶向抑制药物.适配体(aptamer)是人工合成的一段随机DNA、RNA或肽 ,其在足够长的序列下 ,理论上可以形成任何三维结构.因此 ,经过几次筛选后 ,可以找到与靶点特异性结合的核酸或肽段序列.相比抗体 ,适体技术可以高效、大规模筛选和生产特异靶点序列 ,且这些分子更容易进入细胞 ,药效更稳定持久.该技术已被应用于新型抑菌药物的开发、特异配体序列的寻找以及生物大分子结构与功能研究等多个领域[41].例如 ,Li et al[42]设计了与致病大肠杆菌K88 pili特异结合的DNA适配体 ,使病原菌鞭毛蛋白无法结合到宿主表面的受体 ,进而不能入侵宿主 ,并且已经在体外取得显著效果.此外 ,陈伶利等[43]利用适配体技术筛选出23个与TolC特异结合的DNA序列 ,可作为外排泵的抑制剂.
3.3 新型抑菌策略
根据外膜蛋白是多种必需营养物质进出通道的特性 ,可将抗生素与细菌生存必需物质偶联 ,“骗”过外膜屏障到达细胞内 ,从而增加胞内抗生素浓度 ,该新型抑菌策略称为“特洛伊木马”策略.例如 ,铁离子是细菌生命活动必需的金属元素 ,革兰氏阴性细菌只能靠从外界环境摄取可以螯合铁离子的铁载体 ,并通过外膜蛋白特异通道运输到细胞内.含铁蛋白缺乏会导致细菌死亡 ,细菌很难进化出阻挡该类物质进入胞内的机制.事实上 ,这种方法早已在自然界中存在 ,一些细菌可以分泌与铁离子螯合物共价结合的抗生素 ,通过特异外膜蛋白通道进入胞内从而起到杀菌作用 ,如白霉素等[44].根据此原理 ,科研人员将抗生素或纳米杀菌材料与铁载体人工偶联在一起 ,研发出高效新型抗生素 ,这将是今后该领域发展的一个重要方向[45].
4 总结与展望
综上所述 ,由于全球细菌耐药的形势日益严峻 ,了解细菌耐药与调控新机制 ,设计药物新靶点和抑菌新策略 ,已成为当前科学研究的热点问题.现有研究发现 ,革兰氏阴性细菌的外膜蛋白具有重要的耐药功能.外膜蛋白可以通过控制外膜通道孔径大小限制抗生素进入细胞 ,还可以通过单体或复合物的方式形成外排系统将已进入胞内的抗生素泵出细胞外 ,前者的典型代表为OmpC和OmpF家族 ,后者有TolC家族及其复合物TolC-AcrAB.但是 ,很多外膜蛋白的耐药功能及其调控机制还有待进一步研究.目前 ,通过高通量的组学技术发现了更多的耐药相关差异蛋白及其调控机制 ,但这些蛋白是否具有耐药功能 ,还需要进一步验证.因此 ,分子生物学技术与多“组学”方法结合 ,特别是代谢组学的发展 ,将是今后细菌耐药机制研究的重要方向.此外 ,外膜蛋白介导的其他耐药新机制以及耐药导致外膜蛋白形成差异表达平衡调控网络的发现 ,使有关细菌耐药的内在机理更加清晰 ,这揭示今后的耐药治疗更倾向于多种药物的协同作用[46].
现有的外膜蛋白耐药理论知识 ,为新型抗耐药菌药物的研发奠定了基础.目前已研发出各种抑制耐药外排系统和增加外膜通透性的药物;但是 ,该领域的研究还面临诸多问题 ,如药物的理化性质、溶解性、特异性 ,特别是对哺乳细胞的毒性问题 ,都未得到很好的解决 ,因此多数药物仍然处于科学研究阶段 ,无法用于临床[47].总之 ,细菌耐药过程是一个复杂的生物学过程 ,细菌采取进化突变的策略快速产生耐药性 ,但还有很多耐药机制和复杂调控网络有待进一步研究.
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(责任编辑:杨郁霞)
An review on the antibiotics resistance function of outer membrane protein in gram-negative bacterial and related antimicrobial strategies
LI Wan-xin1 ,2,SUN Li-na1 ,2,LIN Xiang-min1 ,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring ,Fujian Agriculture and Forestry University;2.Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology in Universities of Fujian Province ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)
The emergence of bacterial resistance to drug use has posed serious problem worldwide.Generally ,the drug resistance ca-pability of gram-negative bacteria is stronger than that of gram-positive ,which is partially attributed to the antibiotics resistance of the outer membrane proteins(OMPs).It is well known that the specific OMPs efflux antibiotics out or inhibits uptakes of antibiot-ics ,while the regulation mechanism remains uncertain.With the development of modern science and technology ,especially the ap-plication of structure biology ,molecular biology and proteomics ,many progressive studies have unveiled the mechanisms underlying the antibiotic resistance of OMPs.This review focuses on the recent advances in the structure and antibiotic resistance mechanisms of OMP ,which provides helpful insight into manufacture of new OMPs-targeting antimicrobial drug.
outer membrane protein;antibiotics resistance mechanism;efflux pump system;antimicrobial strategy
Q93-3
A
1671-5470(2015)06-0561-06
10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.001
2015-03-20
2015-07-02
国家自然科学基金项目(31470238、31200105).
李碗芯(1990-) ,女 ,硕士.研究方向:分子生态学.Email:liwx2012@126.com.通讯作者林向民(1977-) ,男 ,教授 ,博士生导师.研究方向:微生物学、分子生态学.Email:xiangmin@fafu.edu.cn.