肿瘤循环线粒体DNA研究现状

金涛辛毅娟

肿瘤循环线粒体DNA研究现状

金涛1辛毅娟2★

近年来日益增多的研究表明，肿瘤在生长过程中会持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液。释放的DNA根据核基因和核外基因分为循环核DNA（nuclear acid， nDNA）和循环线粒体DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）。目前，几乎所有研究都集中于循环nDNA，循环mtDNA鲜有关注。为此，我们从定性和定量两个方面，对国际上已报道的关于循环mtDNA方面的研究进行归类综述，初步探讨循环mtDNA在肿瘤发生发展中的生物学意义进行，阐明循环mtDNA在肿瘤诊断以及疗效监测中潜在的临床应用价值。

肿瘤；循环线粒体DNA；突变；拷贝数

［KEY WORDS］Tumor；Circulating mitochondrial DNA；Mutation；Copy number

1977年Leon等［1］首先发现肿瘤患者血浆循环DNA浓度明显高于非肿瘤患者，且肿瘤转移患者倾向于含有更高水平的血浆循环DNA。随着肿瘤分子生物学的发展，尤其是荧光定量PCR技术的建立，研究者［2-8］陆续发现这些DNA不仅在量上与肿瘤相关，而且在质上也具有肿瘤DNA的特点，如具有类似肿瘤的遗传学和表观遗传学改变，这些改变与肿瘤的发生、发展存在很大关系。上述发现显示出循环DNA检测在肿瘤的早期诊断、鉴别、预后评估方面的重要意义。

目前循环DNA的报道都集中在肿瘤患者血浆中的循环nDNA（nuclear acid，nDNA），但是值得指出的是血浆中还有 nDNA外的 mtDNA （mitochondrial DNA，mtDNA）。相比于nDNA，在拷贝数定量方面，mtDNA具有更多的拷贝数，每个细胞可达上百甚至上千个的拷贝，因此相对于nDNA更容易检测。在突变位点定性检测方面，已有大量的研究［9］表明许多肿瘤的发生发展与mtDNA的突变存在很大的相关性，mtDNA的突变在肿瘤发生发展过程中起到重要作用，某些mtDNA位点的突变会进一步促进肿瘤的发生发展，mtDNA可以作为潜在的一个临床肿瘤诊断指标。与循环nDNA通过细胞坏死，凋亡释放入血的途径有所不同，有研究［10］显示活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多、功能发生紊乱的线粒体可以通过主动外排的形式释放mtDNA。另一研究［11］则提示在细胞凋亡途径受阻时，线粒体中的mtDNA会被选择性的降解。最近，Nakahira等［12］则发现ROS生成增多的线粒体会导致线粒体膜通道的渗透性改变，mtDNA会在炎症因子的介导下从线粒体中释放出来。综上可知，在氧化压力升高、线粒体功能发生紊乱的情况下，细胞中mtDNA会排放到细胞外。因此，胞外血浆中mtDNA的变化，相对于nDNA的释放是不是一种更灵敏的监测肿瘤发生发展的一个指标值得进一步研究证实。

对循环肿瘤DNA的检测可分为定性和定量2种：前者主要指检测血清和血浆中肿瘤特异性基因的改变，后者则检测血清和血浆的DNA拷贝数，两者均可从不同程度反映肿瘤的存在和严重程度。现综述目前为止肿瘤循环mtDNA的相关研究。

1 血浆中循环mtDNA的定性研究

血浆中循环mtDNA突变的报道最先出现在糖尿病研究中。mtDNA3243位点A到G突变是较常见的mtDNA突变位点之一。到目前为止，已经在诸多线粒体疾病中［13-18］检测到该突变。而且，mtDNA3243 A到G突变已证实与糖尿病的一个支系——线粒体母系遗传的Ⅱ型糖尿病的发生有很大的相关性［19-20］。Zhong等［21］对16例Ⅱ型糖尿病患者和25例正常对照的淋巴细胞、血浆及血清mtDNA 3243位点进行筛查后发现，在正常人的血浆及血清中没有检测到3243位点A-G突变，在3243位点没有发生A-G突变的糖尿病患者淋巴细胞中，其血浆和血清中也没检测到相应的突变，而在7例淋巴细胞发生3243A-G突变的糖尿病患者中，其血浆和血清中也相应的检测到3243A-G突变，相应的检测率达到100%，而且在血浆血清中mtDNA突变的异质性水平高于淋巴细胞。该研究提示血浆相对于血液中的淋巴细胞更能反映3243位点的突变情况，血浆中突变的检测可以作为一种新的切入点。

随后，在前列腺癌的相关研究中［22］，研究者检测到16例前列腺癌组织标本中存在3例mtDNA突变，在这3例病人对应的血清及尿液标本中均检测到与组织相同的突变，突变水平相比于细胞有所降低，但是在血液淋巴细胞中并没有检测到相应的mtDNA突变，提示血浆中的mtDNA有部分来源于肿瘤组织，而且血浆和血液淋巴细胞可能代表不同的生物学意义，具有不同的临床诊断价值。同时，又有研究人员［23］运用荧光定量的方法发现77例结直肠癌组织标本中有7例存在mtDNA D-loop区突变。在这7例标本对应的血清样本中，检测到1例血浆样本存在与组织相应的D-loop区71-G缺失突变。同样的方法，研究者［24］在50例肝癌病人组织标本中也检测到15例病人存在mtDNA的突变，在这15例病人对应的血清标本中检测到7例病人存在与组织相同的突变。虽然运用同样的方法，结直肠癌和肝癌中突变检出率却并不相同，原因可能是癌种的不同、癌症分期的不同以及DNA提取方法的不同等。研究指出血浆中突变的mtDNA被正常的循环mtDNA大大稀释；其次，线粒体中mtDNA突变具有异质性的特点，即一个细胞内同时存在突变的和野生型的mtDNA，导致mtDNA突变的水平往往较低。因此尽管仅检出相应的1例突变，但并不意味着血浆中不存在相应的突变mtDNA。血浆循环DNA中低拷贝的突变DNA对检测手段提出了更高要求，但是随着更加精确和灵敏的检测手段的出现，循环DNA中突变的DNA的检测将不再是一个技术难题。

2 血浆中循环mtDNA的定量研究

Chiu等［25］运用荧光定量 PCR的方法对正常人血浆中的mtDNA的拷贝数进行了定量，结果显示荧光定量PCR具有足够的灵敏度检测正常人血浆中少至一个拷贝的微量mtDNA。该研究发现，血浆中mtDNA主要以游离的形式和颗粒结合的形式存在，这2种存在形式的来源机理及其生物学意义是否相同尚未清楚。为了分离2种不同形式的mtDNA，研究者采用了四种不同的血浆处理方式。对比研究后发现，未经过高速离心或0.2 μm膜过滤处理，血浆中游离形式的mtDNA和颗粒结合形式的mtDNA的量有显著地变化，其可能原因是一步离心（1 600 g，10 min）不能有效清除血浆中残留的细胞，每个细胞中含有几千个线粒体，未除尽的细胞将极大地影响最后的定量结果。研究进一步发现，尽管经过了两步离心（1 600 g，10 min；16 000 g再10 min），其效果和未经第二步离心而改用0.2 μm膜过滤的相比也存在差异，提示血浆中循环mtDNA存在较多的非游离的颗粒型mtDNA。进一步，研究者在两步离心的基础上加上第三步，即0.2 μm膜过滤或超高速离心后发现，未经第三步处理的血浆循环mtDNA的量显著升高，证实了血浆中循环mtDNA存在游离型和颗粒结合性两种形式，文章指出颗粒型的mtDNA可能来源于线粒体（直径0.5～1 μm，长度5～10 μm）和血小板（每个含四个拷贝的mtDNA）。该研究成果在今后循环mtDNA血浆处理方法的选择上具有很好的借鉴意义，循环mtDNA可能有两种存在形式，即游离型的和颗粒结合型的，至于以哪种存在形式为主，哪种存在形式和疾病发生相关需要进一步的研究。

在104例3种常见卵巢疾病（卵巢癌、卵巢上皮肿瘤和子宫内膜异位）样本中［26］，研究者发现21例卵巢癌患者血浆中循环nDNA和mtDNA均显著高于36例正常对照和24例卵巢上皮肿瘤患者，存在统计学差异。卵巢癌血浆中循环mtDNA也显著高于23例子宫内膜异位组，但循环nDNA在两组之间不存在显著差异，而且血浆中循环nDNA和循环mtDNA不存在一一对应的关系，提示血浆中循环nDNA和mtDNA可能存在不同的释放机理，代表不同的生物学意义。

而在晚期前列腺癌中，研究者发现，相比于仍存活的病人，80%术后仅有两年存活期的前列腺癌病人的血浆循环mtDNA显著升高［27］。文章指出循环mtDNA拷贝数的升高和肿瘤细胞的增多、肿瘤旁正常组织蛋白酶活性增强存在相关性。通过上述对预后病人生存期的随访和血浆循环mtDNA 和mtRNA的研究，结果提示在前列腺癌诊断和预后评估方面，血浆中循环mtDNA和mtRNA相对于循环nDNA具有更高的灵敏度和特异性，并有望成为前列腺癌术后评估的一个新的参考指标。与上述前列腺癌的研究结果不同，Kohler等［28］在乳腺肿瘤的研究中发现，虽然血浆中循环nDNA 在52例乳腺恶性肿瘤组和26例乳腺良性肿瘤组显著高于70例正常对照组，但是血浆中循环mtDNA在恶性肿瘤和良性肿瘤组均显著低于正常对照组。文章认为，在肿瘤细胞中mtDNA暴露于ROS下，控制复制和转录的D-loop区容易发生突变，该区突变的发生会导致mtDNA的复制速率的下降，最终导致mtDNA拷贝数的降低。而良性肿瘤组中循环mtDNA低于恶性肿瘤组，是由于在癌细胞中mtDNA突变导致细胞整体的呼吸水平的下降，进而导致细胞的代偿效应的发生以弥补正常mtDNA的拷贝数的不足。

最近，有研究显示［29］循环mtDNA作为分子诊断靶标，区分正常人与尤因氏肉瘤的敏感性和准确性为76.1%和86.4%。随后，研究人员［30］针对循环mtDNA的研究现状、机遇与挑战，以及存在的技术瓶颈做了总结和分析，认为如果要深入探讨循环mtDNA在临床诊断中潜在应用价值，扩大样本量是非常必要的。

目前为止，肿瘤中循环mtDNA拷贝数的研究还很少。目前研究显示肿瘤中循环mtDNA的拷贝数绝大多数高于非肿瘤组，主要原因是肿瘤发生发展中有更多的炎症，更多的细胞发生坏死和凋亡进入外周血。而Kohler等［28］在乳腺癌中发现了相反的变化，其可能原因是不同癌种可能存在不同的变化。另外笔者认为该研究需要进一步扩大样本量或者运用另一种方法进行定量检测。相比于循环nDNA，循环mtDNA在检测上更加容易，上述研究也显示循环mtDNA有着更好的区分度，当然这需要更多的研究进行验证。不过循环mtDNA作为一个潜在的肿瘤指标将越来越受到人们的关注。

3 总结

本文对肿瘤血浆中循环mtDNA的相关研究进行了综述，目前为止血浆循环mtDNA的研究主要集中在定量检测，定性检测开展尚少。定量检测优势在于通过对肿瘤的发生发展以及治疗过程中循环mtDNA拷贝数水平变化的监测，来对肿瘤诊断、治疗效果、预后评估进行评价。定性检测则侧重通过对肿瘤相关突变位点的检测，为临床肿瘤诊断提供一种新的途径。循环mtDNA释放进入血液循环的机制认为主要是肿瘤增生或转移导致的细胞凋亡、坏死、炎症的发生，进而引起血浆中mtDNA拷贝数的变化，以及线粒体功能障碍引起的mtDNA的释放。另一方面，几乎已在全部肿瘤中检测到mtDNA突变，其与肿瘤发生的相关性被越来越多的实验所证实，因此血浆循环mtDNA突变的检测有望成为肿瘤诊断的一个新的切入点。

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Research status of circulating mitochondrial DNA of tumor

JIN Tao1，XIN Yijuan2★
（1.Clinical Laboratory，the First People’s Hospital of Yong Kang，Yongkang，Zhejiang，China，321300；2.Clinical Laboratory，Xijing Hospital，Xian，Shanxi，China，710000）

In recent years，a growing number of studies have shown that tumor and non-tumor cells continually release DNA into peripheral blood in the progress of tumor growth.According to the source of circulating DNA，they are divided into circulating mitochondria DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）and circulating nuclear DNA （nuclear acid，nDNA）.To date，almost all studies focus on circulating nDNA research，as circulating mtDNA receives little attention.In this review，recent studies on circulating mtDNA qualitatively and quantitatively are concerned.We try to discuss the biological significance of circulating mtDNA in the development of the tumor and the potential clinical value in cancer diagnosis and therapeutic effect evaluation.

国家科技部863计划（2011AA02A110）

1.永康市第一人民医院检验科，浙江，永康 321300 2.西安市西京医院检验科，陕西，西安 710000

辛毅娟，E-mail：xy850510@126.com