IL-8促进A549细胞迁移过程中对线粒体融合与分裂基因表达的影响*

张 钰， 高宇飞， 苏 静， 于春艳， 贺宜春， 孙连坤△

(1吉林大学基础医学院病理生理学教研室，吉林 长春 130021; 2吉林大学白求恩第三医院神经外一科，吉林 长春 130033； 3北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013)



IL-8促进A549细胞迁移过程中对线粒体融合与分裂基因表达的影响*

张 钰1， 高宇飞2， 苏 静1， 于春艳3， 贺宜春2， 孙连坤1△

(1吉林大学基础医学院病理生理学教研室，吉林 长春 130021;2吉林大学白求恩第三医院神经外一科，吉林 长春 130033；3北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013)

目的： 探讨IL-8作用下人肺腺癌A549细胞的迁移率变化以及线粒体融合与分裂基因的变化。方法：实验分为对照组和IL-8作用组。采用细胞划痕实验方法观察IL-8作用下细胞迁移能力的变化；Transwell小室检测细胞的迁移率；ELISA实验检测不同迁移率的细胞内源性IL-8的分泌量；Western blot法检测线粒体外膜蛋白Tom20及线粒体膜间腔蛋白细胞色素C(cytochrome C， Cyt C)的表达。RT-PCR检测线粒体融合基因Mfn1、Mfn2、OPA1及分裂基因Fis1、Drp1、MTP18的表达；MitoTracker Red CMXRos染色激光共聚焦显微镜观察细胞中线粒体的形态。结果：肺腺癌A549细胞的迁移率高于SPC-A-1细胞，且内源性IL-8的分泌也高于SPC-A-1细胞。IL-8作用下A549细胞的迁移率增加，并存在时间依赖性。与对照组比较，IL-8作用组的A549细胞线粒体膜间腔蛋白Cyt C蛋白表达降低(P<0.05)，外膜蛋白Tom20表达增加(P<0.05)，线粒体外膜融合基因Mfn1及Mfn2表达增加(P<0.05)，内膜融合基因OPA1表达降低(P<0.05)，分裂基因Fis1无明显变化(P>0.05)，Drp1及MTP18增加(P<0.05)；激光共聚焦显微镜显示IL-8作用下线粒体形态发生变化，出现点状聚集。结论：A549细胞在IL-8作用下迁移率增加，可能与A549细胞线粒体融合与分裂基因变化有关。

肺腺癌； 细胞迁移； 线粒体； IL-8

研究人员普遍认为趋化因子不仅与炎症和造血过程中促进白细胞的迁移相关，近年来研究还发现，其与白细胞浸润、肿瘤血管生成、肿瘤细胞生长及转移也密切相关[1]。A549细胞是肺腺癌细胞中一种增殖快、恶性程度高的低分化细胞株[2]，易发生迁移。肺癌细胞可以通过淋巴道进行转移，其中白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)是一种趋化因子，促进肿瘤细胞的增殖、分化和转移[3]。有研究人员发现肺腺癌细胞A549的趋化性和侵袭性也可能与线粒体的动态分布及极性相关[4]。因此，本实验探讨IL-8对A549细胞迁移能力的影响以及对线粒体融合与分裂基因表达的影响，进而明确IL-8促进A549细胞迁移过程中，线粒体内、外膜融合与分裂基因的动态改变与细胞迁移的关系。

材 料 和 方 法

1 细胞、主要试剂和仪器

人肺腺癌A549细胞、人肺腺癌SPC-A-1细胞由吉林大学基础医学院病理生理学教研室保存。抗细胞色素C(cytochrome C, Cyt C)和抗Tom20抗体购于Santa；抗β-actin抗体购于EPITOMICS；重组人IL-8购于PeproTech；II抗购自Proteintech；Transwell小室(8.0 μm)购于Millipore；RMPI-1640 培养基购自Gibco；化学发光增强显色液(ECL)试剂购于Thermo； ECL显色系统购自Gene；PCR引物购于上海吉玛；MitoTracker Red CMXRos购于Invitrogen。SDS、丙烯酰胺、苏木精及其它试剂均由长春宝信生物技术有限公司提供。蛋白质电泳装置及转移系统购于Bio-Rad。

2 细胞培养

A549细胞置于完全培养基(含10%胎牛血清，RPMI-1640培养基，pH 7.3)中进行培养，37 ℃、5% CO2条件下进行培养。0.25%胰酶消化传代，取处于对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、IL-8作用24 h组、IL-8作用48 h组。

3 实验方法

3.1 细胞划痕实验 实验前一晚用直尺和Marker笔在超净台内紫外灯下照射过夜。铺板前用Marker笔在6孔板背面，沿着直尺，每隔0.8 cm划1 条横线，横穿过孔。每孔划4条线。将A549细胞制成悬浮液，以每孔5×105的密度接种于6孔板中。待细胞铺满孔板后，用200 μL的移液器枪头比量直尺，尽量垂直于背后的Marker笔横线进行划痕。划痕后，用1 mol/L PBS冲洗细胞3次。换新鲜培养基，同时加入IL-8。选取位置并标记后进行拍照，放入37 ℃、5% CO2孵箱中进行培养。24 h、48 h后观察并在相同位置进行拍照并保存图像。

3.2 Transwell小室迁移实验 实验前将Transwell小室放入培养板中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，分别将A549细胞悬浮液，以每孔5×105的密度接种于6孔板中，细胞种在上室内，下室内加入培养液。经预实验表明A549细胞在种植4 h后开始贴壁。贴壁后进行迁移，迁移时间为24 h和48 h。24 h和48 h后进行苏木精染色或用0.25%的胰酶进行消化，收集上室内细胞及下室内细胞，进行计数。

3.3 ELISA实验检测不同迁移率的细胞其内源性IL-8的分泌量 收集A549细胞及SPC-A-1细胞上清液。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，并进行混匀，精确反应蒸馏水调零，检测450 nm吸光度值。按照说明书进行计算。

3.4 Western blot法检测Cyt C和Tom20的表达 加入IL-8作用24 h，刮取细胞，并800 r/min离心收集细胞，预冷的PBS 洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液并提取蛋白，检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE分离蛋白，采用Bio-Rad蛋白质电泳装置及转移装置将蛋白移至PVDF 膜，转膜结束后将PVDF膜放入5% 的脱脂奶粉中进行封闭，封闭膜上的非特异结合位点，2～4 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加入Ⅰ抗，4 ℃冰箱中过夜。次日PBST 洗膜3 次，每次10 min，加入Ⅱ 抗，室温孵育1.5 h，倒掉Ⅱ抗，PBST洗膜3 次，每次10 min，ECL显色系统进行显色，采集图像后保存。

3.5 RT-PCR检测线粒体基因Mfn1、Mfn2、OPA1、Fis1、Drp1和MTP18的表达 用Trizol试剂提取细胞总RNA, 采用逆转录酶、oligo(dT)18和dNTP将总RNA逆转录成cDNA, 从中取1 μL进行PCR反应。以GAPDH为内参照, 引物序列及PCR 产物片段大小见表1。PCR反应条件为94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, Mfn1、OPA1、Drp1和Fis1为35个循环，GAPDH 为27个循环。

3.6 MitoTracker Red CMXRos激光共聚焦显微镜观察线粒体形态 细胞置于24孔板里的盖玻片上培养过夜，IL-8作用24 h后，用MitoTracker Red CMXRos 染料37 ℃孵育30 min。4%的多聚甲醛固定，用Hoechst 33342(1 μg/L，Sigma)染细胞核2 min，1 mol/L PBS冲洗3次。Olympus FV1000共聚焦显微镜观察细胞线粒体形态。采集图像后保存。

4 统计学处理

电泳条带密度值以灰度×面积/参照物的比值表示。各组数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件分析，各实验组间均值比较采用t检验或方差分析。

结 果

1 A549细胞和SPC-A-1细胞的迁移情况和内源性IL-8的分泌

采用SPSS 21.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

Transwell小室实验结果表明，在无IL-8刺激的情况下，A549细胞的迁移率显著高于SPC-A-1细胞 (P<0.05)，但都处于较低水平。ELISA法检测结果表明A549细胞中内源性IL-8的分泌量显著高于SPC-A-1细胞(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The migration and IL-8 secretion of A549 cells and SPC-A-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsSPC-A-1.

图1 A549细胞与SPC-A-1细胞的迁移情况和内源性IL-8的分泌

2 IL-8对A549细胞迁移能力的影响

Transwell小室实验结果表明，与对照组相比，IL-8(100 μL/mL)处理12 h和48 h后A549细胞的迁移能力明显增加。细胞划痕实验结果表明，与对照组相比，IL-8(100 μL/mL)处理12 h和48 h后A549细胞由划痕边缘向中间的迁移距离明显增加，见图2、表2。

Figure 2.The effect of IL-8 treatment for different time on the migration of A549 cells (×200).

图2 A549细胞经IL-8作用不同时间的迁移情况

表2 A549细胞经IL-8作用不同时间的迁移情况

Table 2.The effect of IL-8 on the migration of A549 cells at different time points detected by Transwell assay and scratch assay (Mean±SD.n=3)

GroupTransmembranecellnumber(cells/field)Thedistancetothecenterline(mm)Control18.0±1.716.00±1.21IL-8(24h)39.0±8.3*6.20±1.09*IL-8(48h)72.0±14.4*1.40±0.95*

*P<0.05vscontrol.

3 Western blot法检测IL-8对A549细胞Tom20及Cyt C蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示，与对照组比较，A549细胞的Tom20蛋白表达增加(P<0.05)，IL-8处理组的Cyt C蛋白表达降低(P<0.05)，见图3。

4 RT-PCR法检测IL-8对A549细胞线粒体融合基因Mfn1、Mfn2和OPA1表达水平的影响

RT-PCR结果显示，与对照组比较，IL-8处理组A549细胞线粒体外膜融合基因Mfn1和Mfn2水平增加(P<0.05)，线粒体内膜融合基因OPA1水平降低(P<0.05)，见图4。

Figure 3.The effects of IL-8 on Tom20 and Cyt C protein expression in the A549 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图3 Western blot法检测IL-8对A549细胞线粒体Cyt C及Tom20蛋白表达的影响

5 RT-PCR法检测IL-8对A549细胞线粒体分裂基因Fis1、MTP18和Drp1表达水平的检测

RT-PCR结果显示，与对照组比较， IL-8处理组A549细胞线粒体分裂基因的表达Fis1无显著变化(P>0.05)，MTP18和Drp1表达均增加(P<0.05)，见图5。

6 MitoTracker Red CMXRos激光共聚焦显微镜观察IL-8作用前后A549细胞线粒体的形态改变

与对照组比较，IL-8处理组的A549细胞的线粒体发生点状聚集，见图6。

讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中脑部为肺癌远处转移的部位之一，其发生率高，约为23%～62%，且后果严重[4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族能够促进内皮细胞生长及血管生成，有助于肿瘤的侵袭和转移，并在肺癌脑转移过程中发挥一定作用[5]。此外，炎症趋化因子、生长因子、神经免疫调节因子、癌胚抗原、抑癌基因等因素也成为肺癌脑转移的影响因素[6-7]。IL-8作为炎症趋化因子，与其相应受体CXCR1、CXCR2结合后，通过G蛋白信号传递链引起生物学效应，促进肿瘤细胞的增殖、分化和转移[3]。研究人员发现IL-8能够调节VEGF的表达，从而增加肿瘤细胞的黏附能力和侵袭能力[8]。在IL-8诱导肿瘤细胞产生迁移的过程中，除自身的能量及代谢的需求外，还需额外为细胞迁移提供能量。因此，线粒体可能在此过程中发挥一定的作用。

Figure 4.The effects of IL-8 on the mRNA expression of Mfn1, Mfn2 and OPA1 in the A549 cells determined by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 RT-PCR法检测IL-8对A549细胞线粒体融合基因Mfn1、Mfn2和OPA1表达的变化

Figure 5.The effects of IL-8 on the mRNA expression of Fis1, Drp1 and MTP18 in the A549 cells determined by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图5 RT-PCR法检测IL-8对A549细胞线粒体融合基因Fis1、Drp1和MTP18表达水平的影响

Figure 6.The formation of punctate aggregates in the mitochondria of the A549 cells treated with IL-8 observed under confocal microscope (×1 200).

图6 激光共聚焦显微镜观察A549细胞线粒体的形态变化

线粒体的结构主要包含线粒体外膜、线粒体膜间腔、线粒体内膜和线粒体基质4个部分[9]。其中，线粒体外膜主要参与一些生化反应，如脂肪酸链的延伸；同时也能对那些将在线粒体基质中进行彻底氧化的物质进行初步分解。线粒体膜间腔作为线粒体外膜与内膜的中间结构，含有相关的可溶性酶类及底物。线粒体的内膜包裹线粒体基质，内膜蛋白质含量明显高于线粒体外膜的蛋白质含量，因此也负担更多的生化反应，参与ATP的合成，也能调控线粒体的融合与分裂。线粒体的基质中含有多种物质，包括线粒体DNA、RNA及核糖体。Tom20为线粒体外周蛋白Tom复合物外周亚基中的一种。Tom20能够识别蛋白前序列和非折叠的成熟前蛋白，以及成熟蛋白或体积较大的疏水性前体蛋白，并且其功能区还有分子伴侣的活性，能够维持底物前蛋白的非折叠状态，防止在线粒体聚集[10]。线粒体外膜蛋白Tom20的增加可能与线粒体外膜形成相关。此外线粒体作为细胞内的供能中心能够通过线粒体信号，如细胞色素C 信号启动细胞凋亡[11]。Cyt C存在于膜间腔线粒体内膜外侧，与线粒体呼吸链的传递及细胞凋亡密切相关，Cyt C的释放能够促进细胞凋亡。我们的结果显示，在IL-8作用下，细胞色素C蛋白表达量明显降低，结果表明，细胞色素C释放降低时，可能会抑制肿瘤细胞的凋亡。

研究证明，线粒体融合与分裂之间的动态平衡是维持线粒体生理功能及形态的重要影响因素。线粒体在融合前，Mfn1 和Mfn2 形成寡聚体绑定在线粒体外膜上[12]。线粒体的融合是一个复杂的过程，包括线粒体在胞质中运动、线粒体膜的改变、外膜的融合、内膜的对接和融合、线粒体DNA 和基质的混合[12]。Mfn1/2 是调控线粒体融合的主要分子，在线粒体融合过程中发挥重要作用，而且Mfn1 与Mfn2 可能在线粒体融合的不同阶段起作用。Mfn1 主要在融合的前期促进线粒体间的彼此结合，Mfn2 主要在线粒体融合反应的后期起作用，如促进线粒体融合，有利于内膜对接等。线粒体的内膜融合是由OPA1介导的，OPA1定位于线粒体膜间腔，它的缺失与线粒体自噬及线粒体片段化的形成有关[13-15]。

线粒体分裂有时会形成膜电势不均一的子代线粒体，其中一个子代线粒体的膜电势增高，而另一个子代线粒体的膜电势会减低。膜电势增高的子代线粒体容易与其它线粒体融合，而膜电势低的线粒体难于融合，并且线粒体上介导线粒体融合的分子OPA1 的水平降低，最终会被自噬性吞噬[13]，从而使线粒体维持融合和分裂的稳态[15]。Drp1与Fis1参与并调控线粒体的分裂。Fis1 定位在线粒体上，将Drp1 募集到线粒体上形成指环状结构，将线粒体挤压断裂[14-16]，从而发挥使线粒体分裂的作用。MTP18是一种18 kD 的蛋白质，定位于线粒体的膜间隙，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号传递的下游执行分子，可能起到将Drp1募集到线粒体外膜的作用[17]。过表达Fis1会诱导线粒体的断裂并引发自噬，而过表达OPA1、敲减Fis1则抑制线粒体自噬的发生[14]。

本实验结果显示，线粒体外膜融合基因Mfn1与线粒体外膜蛋白Tom20表达的趋势一致，IL-8能够促进A549细胞的线粒体外膜融合基因Mfn1和Mfn2的表达，增加线粒体外膜蛋白的表达，但降低线粒体内膜融合基因OPA1的表达。OPA1的水平降低可能是发生了线粒体自噬，线粒体自噬在一定程度上有利于线粒体维持其正常功能。而线粒体分裂相关基因Drp1和MTP18的表达略增加。线粒体形态发生改变，点状聚集增加。以上结果表明，IL-8能够促进A549细胞线粒体外膜融合增加、内膜的融合降低，并可能伴随线粒体自噬这种线粒体的动态改变，可能是IL-8促进A549细胞迁移的机制之一。而线粒体结构的具体变化以及功能的异常与肿瘤细胞迁移与侵袭之间的关系还需深入研究。

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Effect of IL-8 on mitochondrial fusion and fission gene expression in human lung adenocarcinoma cell line A549 during cell migration

ZHANG Yu1, GAO Yu-fei2, SU Jing1, YU Chun-yan3, HE Yi-chun2, SUN Lian-kun1

(1DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China;2TheFirstDepartmentofNeurosurgery,TheThirdNormanBethuneHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;3DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,BeihuaUniversity,Jinlin132013,China.E-mail:Sunlk@jlu.edu.cn)

AIM: To investigate the changes of migration of lung adenocarcinoma cells promoted by IL-8 and the inner and outer mitochondrial membrane dynamic changes during this process. METHODS: Human lung adenocarcinoma cell line A549 was divided into control group and IL-8 group. Cell migration was analyzed by scratch detection and Transwell assay. The secretion of endogenous IL-8 was detected by ELISA. The protein levels of mitochondrial cytochrome C (Cyt C) and mitochondrial outer membrane protein Tom20 was detected by Western blot. The mRNA expression of mitochondrial fusion genesMfn1,Mfn2andOPA1 and fission genesFis1,Drp1andMTP18 was detected by RT-PCR. The morphological changes of mitochondria were observed by MitoTracker Red CMXRos dye staining and confocal microscopy. RESULTS: The migratory rate of A549 cells and endogenous secretion of IL-8 in A549 cells were higher than those in SPC-A-1 cells. The migratory rate of A549 cells was improved by IL-8 in a time-dependent manner. Compared with control group, the Tom20 protein expression was increased (P<0.05), and the Cyt C protein expression was decreased (P<0.05). The expression of mitochondrial outer membrane fusion genesMfn1 andMfn2 was increased (P<0.05), and the expression of mitochondrial inner membrane fusion geneOPA1 was decreased (P<0.05). The expression of fission genesDrp1 andMTP18 were decreased (P<0.05), while the expression ofFis1 was no change (P>0.05). Under confocal microscope, the punctate aggregates in the mitochondria of the A549 cells treated with IL-8 were observed. CONCLUSION: The migratory rate of A549 cells is increased by IL-8, which is related to the changes of mitochondrial fusion genes and the fission genes.

Lung adenocarcinoma; Cell migration; Mitochondria; IL-8

1000- 4718(2015)04- 0597- 06

2014- 10- 14

2015- 02- 04

国家自然科学基金资助项目(No.81272876;No.81372696)；中国博士后科学基金资助项目(No.2013M541314)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(No.2009-36)

R730.23; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.004

△通讯作者 Tel: 0431-85613485; E-mail: sunlk@jlu.edu.cn