论华法林相关基因突变检测技术

孙雪1，2 况赟1，2 阳喜定1，2 郭成贤2 阳国平2★

论华法林相关基因突变检测技术

孙雪1，2 况赟1，2 阳喜定1，2 郭成贤2 阳国平2★

华法林为一种常用的口服抗凝药，主要用于治疗血栓栓塞性疾病。但其治疗窗窄、个体差异大，容易引起血栓或出血的风险。代谢酶CYP2C9和作用靶点VKORC1基因多态性对华法林个体剂量差异有显著影响，因此CYP2C9和VKORC1基因突变的检测对于华法林的个体化治疗具有重要的参考价值。目前用于CYP2C9和VKORC1突变检测的方法有PCR-RFLP、TaqMan、pyrosequencing、HRM、POCT、熔解曲线分析技术、MS、DHPLC等。本文将对这些检测方法的特点进行比较分析，以发现适合临床应用推广的技术检测方法。

华法林；CYP2C9；VKORC1；基因突变检测

自2009年国际华法林药物基因组协会（International Warfarin Pharmacogenetics Consortium，IWPC）推出华法林剂量计算公式以来，国内外对华法林的随机对照临床研究成为遗传药理学研究的一项热点。近年来大多数临床试验旨在探索代谢酶Cytochrome P450 2C9（CYP2C9）*2（rs1799853）、*3（rs1057910）和作用靶点维生素K环氧化物还原酶1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）（rs9923231）对华法林剂量的影响，并对IWPC公式进行修正及验证等。有研究表明，CYP2C9*2及*3可解释华法林个体剂量差异的12％，而VKORC1可解释华法林个体剂量差异的30％［1］。因此，在华法林的临床应用中对CYP2C9及VKORC1进行基因突变检测显得十分重要。高效灵敏的CYP2C9、VKORC1基因突变检测技术能为华法林个体治疗提供快捷的指导。本文将对CYP2C9、VKORC1基因突变检测方法的研究近况进行综述，以期发现适合临床应用推广的检测方法。

1　常用的检测方法

1.1聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP是用特异设计的PCR引物扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，并直接在凝胶电泳上分辨的方法。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，会产生不同长度的DNA片段条带。该法与限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）相比，区别是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤，具有方法简便、分型时间短等优点。PCR-RFLP大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，是目前国内外华法林研究最为常用的基因突变检测方法［2-9］。

Gu等［10］在进行华法林影响因素的研究时，使用了PCR-RFLP对127名关节置换患者及133名健康对照者DNA样本进行CYP2C9及VKORC1三个位点的基因分型，结果表明该法分型快速而准确。

1.2TaqMan等位基因辨别分析

TaqMan等位基因辨别分析采用不同的荧光基团分别标记两种特异探针，探针的两端分别标记了荧光基团和淬灭基团。在PCR延伸过程中，具有5＇→3＇外切活性的DNA聚合酶只外切并降解与模板完全互补的探针，当被外切后，荧光基团和淬灭基团分离，从而激发出荧光。如果一种荧光信号明显强于另一种，则表明该基因型为野生型。如果2种荧光信号都增强，则表明其为突变型。

TaqMan技术的优点在于仅使用一个反应且操作简单，可以在单管反应中检出样本的基因型，可以在2小时内快速对96个样本进行基因突变的检测。TaqMan技术最先在Sevall发表的文章中提及［11］。2010年1项对Invader、Verigene和TaqMan三种基因突变检测方法进行50个样本分型的对比研究表明，TaqMan基因检测方法较为经济，且所需样本DNA量较其他两种方法少，仅需5～20 ng［12］。

2009年IWPC建立最大样本量的模型时，即使用了TaqMan对5 052个样本进行CYP2C9及VKORC1的基因分型［13］。该研究通过随机抽取480个样本进行基因分型的质量控制，结果表明，Taq-Man对CYP2C9基因分型结果的一致性为97.8％，对VKORC1基因分型结果的一致性为97.7％。先后国内外在华法林的研究中，对CYP2C9及VKORC1基因突变检测也广泛应用了该方法［14-18］。

1.3焦磷酸测序法（pyrosequencing）

焦磷酸测序法是测序法的一种，是新近发展起来的基于酶催化化学反应的测序技术，可以快速准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理是4种脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）之一被加入引物延伸反应体系中，当加入的dNTP恰好与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3′末端，同时释放出一分子的焦磷酸，这个焦磷酸分子是一系列后续化学发光反应的必备材料。如果没有掺入dNTP就不会产生光信号，而在加入下一种dNTP之前，反应体系中剩余的dNTP会在酶的作用下发生降解。因此，观察导致发光的dNTP类型就能确定单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的基因型。

焦磷酸测序法具有省时、低费用、准确性高、易于实现全自动化、可对SNP位点进行突变频率的定量分析等优点，是近年来一种备受关注的SNP基因分型方法。与一些标准基因分型方法相比，焦磷酸测序法还存在一些不足。首先，该方法在进行PCR反应时，生物素标记引物价格较高；其次，该方法的应用限于短片段PCR产物（建议不超过200 bp），无法对较长片段的产物进行精确的测序分析，这就限制了焦磷酸测序技术在基因测序中的广泛应用；再者，该方法对测序片段中连续的相同碱基（3个以上）的判读容易出现误差。2008年King等［19］将其与其他三种商业测序方法INFINITI analyzer、Invader assay、Tag-It Mutation Detection assay进行比较研究，对112个样本进行CYP2C9及VKORC1基因分型，结果表明焦磷酸测序法对CYP2C9*2、CYP2C9*3及VKORC1分型的准确率分别为99％、100％、100％，且分型时间约为4小时。

近年又发展了一种单筒聚合酶链式反应-焦磷酸测序法（single-tube PCR-pyrosequencing），且在华法林研究中有应用［20-21］。与简单的焦磷酸测序法相比，该法每次可对96个样本进行测定，具有更省时且更经济的特点。2014年Kim等［22］使用了1种新型的基因突变检测方法，即多元焦磷酸测序对250个样本进行CYP2C9及VKORC1基因突变的检测，其结果与单焦磷酸测序法结果100％一致。测序结果通过直接测序法进行验证，表明多元焦磷酸测序方法所得结果快速而可靠。

1.4高分辨率熔解曲线分析技术（high resolution melting，HRM）

HRM是近几年兴起的SNP及突变研究工具，HRM通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP。不同SNP位点、不同基因型等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM是在熔解曲线分析技术的基础上发展起来的，二者的差别在于，常规熔解曲线升温时每步升高0.5～1℃，而高分辨率熔解曲线每步升温0.02～0.1℃；两种熔解曲线所使用的荧光染料亦不相同，高分辨率熔解曲线必需使用饱和荧光染料，而普通熔解曲线由于对分辨率要求不高，则可使用非饱和荧光染料。HRM由于使用新型的饱和染料和高分辨率的仪器，有着极高的分辨率。

作为新一代的遗传扫描工具，HRM具有灵敏度高、速度快、操作简单、选择性好、价格低廉、实现了真正的闭管操作等优点，使其越来越多的受到了广大研究者的关注［23］。

2012年相关研究者新建立了一种用于检测CYP2C9及VKORC1的HRM方法［24］，对100个华法林治疗患者的样本进行CYP2C9*3及VKORC1的基因分型，并将该方法与传统的PCRRFLP、直接测序法及TaqMan探针法进行了比较，证明了该方法更简单、更经济、更快速。该结果促进了后续华法林研究中对HRM的使用［25-26］。

1.5即时检测（point-of-care testing，POCT）

POCT是一种新型的即时检测技术。2009年欧盟遗传药物学和抗凝治疗（european pharmacogenetics of anticoagulant therapy，EU-PACT）成员发表香豆素类大型随机对照临床试验方案［27］，说明将使用POCT进行基因分型，并指出该方法可在1.5小时内得到分型结果。2011年EU-PACT试验组成员Howard等［28］发表以HyBeacon为探针而建立的新型荧光PCR基因分型方法，并以适用于POCT的标准PCR仪器Genie 1进行分型。该方法从指尖无菌采血或采静脉血于真空管中，直接使用未经提取DNA的血样进行基因分型。该研究通过随机选取128个新鲜或冷冻的血液进行基因分型，同批血样分别在其他实验室进行Taqman及PCR-RFLP分型进行方法验证，结果表明3种方法一致性为100％。2013年EU-PACT研究者将华法林试验结果文章发表于新英格兰杂志［29］，通过对455个患者的样本进行基因分型，表明该方法从收到血样至得到分型结果仅需2小时。通过与标准的Taqman及PCR-RFLP验证比较，结果表明该方法更高效。

POCT的优点在于无需在实验室操作，实现了床旁检测；无需提取DNA，操作简单；耗时短，可快速得到结果，适用于华法林研究及其临床应用；费用较低，每个分析约需50美元，一般研究可以负担；准确性高。但该方法的缺点在于需要特定的HyBeacon探针及Genie 1分型仪器，一般实验室可能尚不具备；POCT目前仅在EU-PACT大型临床试验中得以验证，其准确性有待进一步通过大样本量验证，因此该方法有待临床进一步验证和推广。

2　其他检测技术

2.1熔解曲线分析技术（melting curve analysis）

熔解曲线分析技术的基本原理是利用荧光标记的DNA探针与目标DNA互补，进而发射荧光，而未被结合的荧光标记DNA探针将猝灭。与探针结合序列的多态性将引起碱基对的错配，从而破坏探针，使其融解即变性。与野生型相比，突变型在不同温度下发射的荧光也有相应的改变，荧光的负导数的变化作为温度的函数，将生成表明样本基因型的特征峰。

2008年的一项比较研究表明，该方法的缺陷为目的基因临近的未知基因多态性的干扰，这也限制了该方法的广泛应用［30］。但通过设计更好的探针，可消除该潜在缺陷。

2.2质谱法（mass spectrometry，MS）

MS检测方法的原理是使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸来区分反应产物。各种等位基因区分反应如单碱基延伸及其变化形式、等位基因特异性肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）、Invader、碱基特异性裂解和等位基因特异性PCR均已成功地和质谱检测法联合应用。因为质谱法测定的是DNA分子的基本性质即反应产物的分子量，因而是最直接的检测方法，不需任何标记物。2009年IWPC研究中，部分VKORC1的基因分型即应用了该方法。

MS检测方法的优点是高分辨率，可以轻易区分仅相差一个碱基的DNA分子；分析时间短，分析每个样品只需几毫秒，所以即使MS逐个分析每个样品，检测通量仍然很高；通过合理的设计探针，可实现中度的多重化。MS检测方法的最大缺点是对分析样品纯度要求苛刻，随着对产品纯化过程的改进，可以克服这个不足。

2010年Yang等［31］报告了一种新型的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-filght mass spectrometry，SELDI-TOF MS）分型方法。通过DNA双向测序法对189个样本的SELDI-TOF MS检测结果进行准确性评估，结果一致性为100％。该方法与传统的MS法比较，简化了操作过程，取消了许多繁琐的试验步骤，检测CYP2C9及VKORC1三个位点突变所需时间少于5小时，该分型方法的准确性已通过双向DNA测序得以证实。这种新型的多重复路基因分型方法提供了良好的临床试验平台，促进了华法林个体化用药的临床研究。

2.3变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）

DHPLC是利用发生错配的杂合双链DNA与纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”，在部分加热变性的条件下，更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低，所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来，通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。部分研究者也使用了该方法进行CYP2C9及VKORC1的基因突变检测［32-33］。

与测序法相比，DHPLC简单、快速、敏感性高，不仅可用于已知突变的检测，还可以用于未知突变的扫描。但该方法尚未通过大样本量的验证，因此目前其临床应用相对较少。

3　基因分型试剂盒及平台

基因分型平台不仅可为华法林的大型临床研究提供技术支持，也为华法林的临床应用提供了一定的保障，但基因分型平台需要较特殊的仪器设备。基因分型试剂盒，由于便于携带，操作简便，可为华法林的临床应用带来便利。

3.1目前已获CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型试剂盒

（1）上海百傲科技股份有限公司研发的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒（PCR-芯片杂交法）于2012年获CFDA批准，是国内首个获批准的检测CYP2C9及VKORC1的试剂盒，该试剂盒每次可对12个标本进行基因突变的检测。

（2）中山大学达安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因检测试剂盒（PCR-电化学基因芯片法）也于2014年获CFDA批准，可一次检测24个标本。

3.2目前已获FDA及CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型平台

（1）美国TrimGen公司研发的eQ-PCRTMLC华法林基因分型平台于2009年获得FDA批准上市，510（k）编码为k073071，需使用特殊设备LightCycler® Real-TimePCRSysteminstrumentmodel 1.2［34］。

（2）美国ParagonDx有限责任企业研发的可对CYP2C9和VKORC1快速基因分型分析的平台于2008年获FDA批准上市，510（k）编码为k071867，需使用特殊设备Cepheid Smart Cycler Dx［35］。

（3）美国Nanosphere公司研发的Verigene华法林代谢核酸测试系统于2007年获FDA批准上市，510（k）编码为k070804，需使用特殊设备The Verigene®System［36］。

（4）美国Osmetech分子诊断公司研发的eSensor®华法林敏感性测试，eSensor®XT-8系统于2008年获FDA批准上市，510（k）编码为k073720，需使用特殊设备The eSensor®XT-8 Instrument［37］。

（5）美国GenMark诊断公司研发的eSensor华法林敏感性唾液测试平台于2011年获FDA批准上市，510（k）编码为k110786，需使用特殊设备Oragene·Dx collection device（k110701）models OGD-500，OGD-575，OXD-525 and OYD-500，eSensor®XT-8 Instrument［38］。

（6）美国Autogenomics公司研发的INFINITI 2C9-VKORC1华法林多元检测技术平台于2007年获FDA批准上市，510（k）编码为k073014，需使用特殊设备Autogenomics INFINITI Analyzer［39］。

（7）佛山达安医疗设备有限公司开发生产的电化学基因芯片检测仪，于2014年获CFDA批准，与中山大学达安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因检测试剂盒配套使用。

4　结语

PCR-RFLP及TaqMan技术由于操作简单，耗时短，近年被广泛用于CYP2C9及VKORC1基因突变的检测。HRM及POCT虽然应用时间较短，但由于其具有高灵敏度、高通量且省时、经济等优越性，有望成为CYP2C9及VKORC1基因突变检测的主流方法。MS及DHPLC目前应用于华法林研究尚不多，有待进一步临床研究加以验证。

目前用于CYP2C9及VKORC1基因突变检测的试剂盒较少，国内仅一个试剂盒获CFDA批准上市。美国FDA已批准一些分型平台上市，这些分型平台为华法林的临床研究和应用奠定了一定的基础，但这些分型平台均需要较特殊的仪器设备，尚未得到普遍应用。因此研发高准确性、高灵敏度、简单、省时、经济的CYP2C9及VKORC1基因分型平台及试剂盒，对华法林的临床研究及使用均具有重要意义。

华法林为抗凝治疗的一线药物，但由于个体差异大，易引起血栓及出血等风险，导致其在中国的使用率非常低。多项研究表明CYP2C9及VKORC1对个体剂量差异有显著影响，因此有效的基因分型方法对华法林的临床应用有重要的意义。通过对上述分型方法的分析比较，PCR-RFLP、TaqMan由于操作简便、省时、且通过了大量研究验证等特点，均适于临床推广应用。HRM由于省时、操作简便、价格低廉等更突出的优越性，加以大样本验证，最适于临床推广应用。POCT具备极为省时且操作简单、准确性高等特点，如果其所需的特殊探针及仪器设备能够普及，则推荐其大规模临床应用。

［1］Wadelius M，Chen LY，Lindh JD，et al.The largest prospective warfarin-treated cohort supports geneti forecasting［J］.Blood，2009，113（4）：784-792.

［2］Zhang H，Yang L，Feng Q，et al.Association between VKORC1genepolymorphismsandischemiccerebrovascular disease in Chinese Han population［J］.J Mol Neurosci，2014，53（2）：166-170.

［3］Natarajan S，Ponde CK，Rajani RM，et al.Effect of CYP2C9 and VKORC1 genetic variations on warfarin dose requirements in Indian patients［J］.Pharmacol Rep，2013，65（5）：1375-1382.

［4］Nahar R，Saxena R，Deb R，et al.Pharmacogenetic typing for oral anti-coagulant response among factor V Leiden mutation carriers［J］.Indian J Hum Genet，2012，18（3）：326-331.

［5］Gaikwad T，Ghosh K，Kulkarni B，et al.Influence of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms on warfarin dosage，over anticoagulation and other adverse outcomes in Indian population［J］.Eur J Phar macol，2013，10（1-3）：80-84.

［6］Nahar R，Deb R，Saxena R，et al.Variability in CYP2C9 allele frequency：a pilot study of its predicted impact on warfarin response among healthy South and North Indians［J］.Pharmacol Rep，2013，65（1）：187-194.

［7］余靓平，宋洪涛，曾志勇，等.基于药物基因组学的华法林给药模型的验证［J］.中华心血管病杂志，2012，40（7）：614-619.

［8］Ivashchenko D，Rusin I，Sychev D，et al.The frequency of CYP2C9，VKORC1，and CYP4F2 polymorphisms in Russian patients with high thrombotic risk［J］.Medicina（Kaunas），2013，49（12）：517-521.

［9］Djaffar-Jureidini I，Chamseddine N，Keleshian S，et al. Pharmacogenetics of coumarin dosing：prevalence of CYP2C9 and VKORC1 polymorphisms in the Lebanese population［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2011，15（11）：827-830.

［10］Gu Q，Kong Y，Schneede J，et al.VKORC1-1639G＞A，CYP2C9，EPHX1691A＞G genotype，body weight，and age are important predictors for warfarin maintenance doses in patients with mechanical heart valve prostheses in southwest China［J］.Eur J Clin Pharmacol，2010，66（12）：1217-1227.

［11］Sevall JS.Rapid allelic discrimination from real-time DNA amplification［J］.Methods，2001，25（4）：452-455.

［12］Lefferts JA，Schwab MC，Dandamudi UB，et al.Warfarin genotyping using three different platforms［J］.Am J Transl Res，2010，2（4）：441-446.

［13］Klein TE，Altman RB，Eriksson N，et al.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmaco genetic data［J］.N Engl J Med，2009，360（8）：753-764.

［14］娄莹，韩璐璐，李彦，等.六种基因多态性对中国汉族人群华法林稳定剂量的影响［J］.中华医学遗传学杂志，2014，31（3）：367-371.

［15］Botton MR，Bandinelli E，Rohde LE，et al.Influence ofgenetic，biological and pharmacological factors on warfarindoseinaSouthernBrazilianpopulationof European ancestry［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，72（3）：442-450.

［16］Yin OQ，Gallagher N，Fischer D，et al.Effects of nilotinibonsingle-dosewarfarinpharmacokineticsand pharmacodynamics：a randomized，single-blind，two-period crossover study in healthy subjects［J］.Clin Drug Investig，2011，31（3）：169-179.

［17］Mazzaccara C，Conti V，Liguori R，et al.Warfarin anticoagulant therapy：a southern Italy pharmaco geneticsbased dosing model［J］.Plos One，2013，8（8）：1-8.

［18］You JH，Wong RS，Waye MM，et al.Warfarin dosing algorithm using clinical，demographic and phar macogenetic data from Chinese patients［J］.J Thromb Thrombolysis，2011，31（1）：113-118.

［19］King CR，Porche-Sorbet RM，Gage BF，et al.Performance of commercial platforms for rapid genotyping of polymorphisms affecting warfarin dose［J］.Am J Clin Pathol，2008，129（6）：876-883.

［20］施宏，虞闰六，马金飞，等.单管PCR-Pyrosequencing快速检测华法林代谢酶基因多态性的建立［J］.遗传，2011，33（11）：1283-1290.

［21］Okada Y，Nakamura K，Adachi A，et al.Development of a single-tube PCR-pyrosequencing method for the simultaneous and rapid detection of four variant alleles of CYP2C9 gene polymorphism［J］.J C lin Pharm Ther，2008，33（2）：187-192.

［22］Kim KA，Song WG，Lee HM，et al.Multiplex pyrosequencing method to determine CYP2C9*3，VKORC1*2，and CYP4F2*3 polymorphisms simultaneously：its application to a Korean population and comparisons with other ethnic groups［J］.Mol Biol Rep，2014，41（11）：7305-7312.

［23］Zhou L，Myers AN，Vandersteen JG，et al.Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye［J］.Clin Chem，2004，50（8）：1328-1335.

［24］崔广林，丁虎，徐宇军，等.高分辨率熔解曲线方法在指导华法林使用起始剂量基因分型中的应用及临床各种基因分型方法的比较［J］.中华心血管病杂志，2012，40（6）：477-481.

［25］庄文芳，吴德沛，王兆钺.上海地区服用华法林人群相关基因型及非遗传因素对用药剂量的影响［J］.中华血液学杂志，2014，35（1）：13-17.

［26］Chen C，Li S，Lu X，et al.High resolution melting method to detect single nucleotide polymorphism of VKORC1 and CYP2C9［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014， 7（5）：2558-2564.

［27］van Schie RM，Wadelius MI，Kamali F，et al.Genotype-guided dosing of coumarin derivatives：the E uropean pharmacogenetics of anticoagulant therapy（EUPACT）trial design［J］.Pharmacogenomics，2009，10（10）：1687-1695.

［28］Howard R，Leathart JB，French DJ，et al.Genotyping for CYP2C9 and VKORC1 alleles by a novel point of care assay with HyBeacon probes［J］.Clin Chim Acta，2011，412（23-24）：2063-2069.

［29］Pirmohamed M，Burnside G，Eriksson N，et al.A randomized trial of genotype-guided dosing of warfarin［J］. N Engl J Med，2013，369（24）：2294-2303.

［30］Carlquist JF，McKinney JT，Nicholas ZP，et al.Rapid melting curve analysis for genetic variants that underlie inter-individual variability in stable warfarin dosing［J］. J Thromb Thrombolysis，2008，26（1）：1-7.

［31］Yang S，Xu L，Wu HM.Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms influencing warfarin drug response by surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight（SELDI-TOF）mass spectrometry［J］. J Mol Diagn，2010，12（2）：162-168.

［32］黄盛文，向道康，吴海丽，等.五种基因多态性对华法林用量个体差异影响的研究［J］.中华医学遗传学杂志，2011，28（6）：661-665.

［33］Huang SW，Chen HS，Wang XQ，et al.Validation of VKORC1 and CYP2C9 genotypes on interindividual warfarin maintenance dose：a prospective study in Chinese patients［J］.Pharmacogenet Genomics，2009，19（3）：226-234.

［34］Howard D.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073071，2009-02-06/ 2014-12-21.

［35］Deborah K.510（k）summary［EB/OL］.http：//www. accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k071867，2008-04-28/ 2014-12-21.

［36］Sue K.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k070804，2007-09-17/2014-12-21.

［37］Robert D.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073720，2008-07-17/2014 -12-21.

［38］John R.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf11/k110786，2011-12-02/2014 -12-21.

［39］Evelyn L.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073014，2008-01-28/2014 -12-21.

The overview of warfarin related gene mutation detection technologies

SUN Xue1，2，KUANG Yun1，2，YANG Xiding1，2，GUO Chengxian2，YANG Guoping2★
（1.Pharmaceutical College of Central South University，Changsha，Hunan，China，410013；2.Center of Clinical Pharmacology，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan，China，410013）

Warfarin is a kind of commonly prescribed oral anticoagulant for preventing thromboembolic disease.However，it is prone to cause thromboembolism or bleeding due to its narrow therapeutic window. The predominant polymorphisms in CYP2C9 and VKORC1 genes，encoding for metabolizing enzyme cytochrome P450 2C9（CYP2C9）and target enzyme vitamin K epoxide reductase complex subunit 1（VKORC1），have significant impact on individual differences in dose requirement.So the detection of CYP2C9 and VKORC1 mutation has important reference value to individualized therapy.At present，the usually detection methods of CYP2C9 and VKORC1 include PCR-RFLP，TaqMan，pyrosequencing，HRM，POCT，melting curve analysis，MS，DHPLC，and so on.The characteristics of these detection methods will be compared in this article to find out the most suitable technical detection methods for clinical application and promotion.

Warfarin；CYP2C9；VKORC1；Gene mutation detection

科技部国际科技合作与交流专项（2014DFA30900）；国家自然科学基金（81373476）

1.中南大学药学院，湖南，长沙410013 2.中南大学湘雅三医院临床药理中心，湖南，长沙410013

阳国平，E-mail：ygp9880@163.com