腺相关病毒载体：通往肿瘤基因治疗的桥梁

陈秀生1 林创珍2 雷川1 翟向明1 聂鑫1 胡奥1 陈思1 杜红延1★

腺相关病毒载体：通往肿瘤基因治疗的桥梁

陈秀生1 林创珍2 雷川1 翟向明1 聂鑫1 胡奥1 陈思1 杜红延1★

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一种有缺陷的非致病的人类细小病毒。腺相关病毒载体作为基因治疗的载体，对长期基因矫正和基因治疗具有一定优越性。由于其低致病性、易操作性等优点，腺相关病毒载体被作为转导目的基因的理想载体，现已广泛地应用于多种肿瘤等疾病的基因治疗研究中。通过对腺相关病毒载体的改造优化，增加其靶向性，减少免疫原性，有望为相关疾病的基因治疗研究提供新的手段和方法。本文就目前腺相关病毒在肿瘤治疗中的应用研究加以综述，旨在对病毒载体在肿瘤生物治疗领域中的应用提供相应的参考。

腺相关病毒；基因治疗；应用；研究进展

基因治疗是生物治疗的重要组成部分，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷基因原本的功能，从而达到治疗分子病的生物治疗方法［1］。该疗法作为一种全新的医疗手段日益引起人们的重视，具有良好的应用前景。该治疗方法的关键在于寻找有效的治疗基因以及如何将安全的治疗基因通过合适的载体运送到靶细胞［2］。传统基因载体分为病毒载体和非病毒载体2类。一般来说，病毒类载体在表达强度和组织靶向性方面比非病毒类载体优越。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一种有缺陷的非致病的人类细小病毒，作为基因治疗的载体，对长期基因矫正和基因治疗具有显著优越性，有着良好的应用前景［3］。腺相关病毒载体是生物技术产品，可发挥较强的抗肿瘤作用，且诱发的免疫反应极低，其临床应用符合相关规定，因此腺相关病毒载体已广泛被应用于癌症、白血病、艾滋病的治疗研究，并已获得美国食品药物管理署（Food and Drug Administration，FDA）批准，进入了临床试验［4］。本文主要就腺相关病毒载体作一综述，讨论其特点、制备方法、不同的改进策略以及在肿瘤基因治疗领域应用的研究进展。

1　腺相关病毒载体

1.1腺相关病毒载体的结构

AAV是一种简单的非致病性的单链DNA病毒，其不自我复制而是依赖于辅助病毒如腺病毒（adenovirus，Ad）或单纯孢疹病毒（herpes simplex virus，HSV）来进行复制［5］。AAV基因组长4 675 bp，两侧是145 bp长的对病毒的复制和包装具有决定性作用的倒转末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs），其中外侧的125个核苷酸呈发夹结构，在复制时有弱启动子作用，中间基因组编码两个蛋白：作为病毒衣壳蛋白的Cap蛋白和参与病毒复制整合的Rep蛋白。Rep蛋白能帮助病毒基因组整合到人类第19号染色体的AAVS1位点［6］。

1.2腺相关病毒载体的安全性

腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特征经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因方向应用的载体。源于非致病的野生型腺相关病毒的重组腺相关病毒载体，通过改造后其具有安全性好、宿主细胞范围广、免疫原性低等特点［7］，有很大的应用前景，在基因治疗和疫苗研发中得到广泛应用。腺相关病毒载体与人类已知疾病没有关联，流行病学资料表明，世界各地大多数人感染过野生型AAV［8］，尚无证据表明AAV的感染与某种疾病的发生有关［9］。另一方面，腺相关病毒载体能转导外源基因进入非分裂细胞，长期表达外源基因，其现已逐渐成为主流的高效基因转移载体，用于神经肌肉基因治疗、神经退行性病变基因治疗等方面［10］。为了提高腺相关病毒载体的安全性，改进措施不断被提出。有研究表明，去掉所有腺病毒基因部分的载体比单纯只删掉E1区域的腺相关病毒载体能够装载更大的外源基因，并减少了细胞毒性反应和免疫原反应。删除腺相关病毒载体的末端反向重复序列能够减少靶基因在宿主细胞内的随机整合［11］。这些改造措施都极大的增强了腺相关病毒载体的安全性。

1.3腺相关病毒载体的靶向性

腺相关病毒载体对不同组织器官的感染效率不同，例如其相较于淋巴细胞、造血干细胞等更偏爱于侵染骨骼肌、肝细胞［12］。腺相关病毒具有多种血清型，在体内能成功转导多种组织，目前已有数种不同血清型的AAV用于基因治疗研究。体内外实验均证明，不同的AAV血清型具有不同的组织或细胞特异性［13］，可利用AAV血清型的不同以及所转导的组织不同来进行靶向治疗，其中AAV8对肝脏的转导效率最高［14］，肌内注射AAV5相较于使用AAV2载体更能增加分泌型转基因产物的血清水平，AAV1载体比AAV5载体更能有效的转导外源基因到肌肉细胞，AAV2载体是目前在临床上运用最为广泛的血清型［15］。研究表明，可以通过基因改造技术来使特异性配体表达于病毒衣壳表面，通过配体与靶组织表面受体特异性结合，从而使AAV载体拥有组织特异性，增强其靶向性。同样，用特定多肽替换AAV结构蛋白的环VI区域能够使AAV载体靶向更广泛的细胞株，如使AAV2载体靶向小鼠黑色素瘤细胞，这是野生型AAV2载体无法做到的［16］。并且有相关研究发现，对不同血清型的腺相关病毒部分单个氨基酸进行突变可以提高靶器官的感染效率［17-18］，这给基因治疗发展又提供了一个有力的支持。

1.4腺相关病毒载体的制备

腺相关病毒载体的制备和纯化工艺在很大程度上决定了最终产品的性质和异物含量。异物主要于腺相关病毒载体的准备阶段引入，包括宿主细胞蛋白、哺乳动物DNA和其他污染物，这些会影响最终产品的免疫原性。现阶段，唯一能应用于人类血管内高剂量注射的AAV载体来源于HEK293细胞的三重转染，多用于治疗血友病B［17］。通过其它技术如杆状病毒表达系统或借助辅助病毒制备的病毒载体同样可用于人类疾病的治疗，但基本都是通过肌内或视网膜下注射［19］。除了使用宿主细胞平台来制备AAV载体，另一个决定载体品质高低的关键因素是下游纯化过程。一般来说，柱层析法并不适合分离空的病毒衣壳，而在纯化过程中加入梯度离心步骤能有效提高分离病毒衣壳的效率［20］。

除了选择表达系统和纯化手段以外，构建腺相关病毒载体也有一定的要求，包括治疗基因的长度不能过大，AAV的总容量为4.7kb；不需要目的基因立刻表达；不需要基因高水平表达等。为了增加AAV介导的基因转导效率，可以构建自身互补AAV（self-complementary adeno-associated virus，scAAV）载体，其含有双链DNA，越过了第二链合成的障碍，但其包装容量只是传统单链AAV包装容量（4.8 kb）的一半［21］。

腺相关病毒载体能够高效的把外源DNA导入真核细胞的细胞核内。为进一步提高腺相关病毒载体的转导效率，还可对其进行优化改造。其中通过修饰病毒衣壳而改变靶向性，或是制造重组载体来提升将外源DNA插入到染色体的效率，这些都能够有效提升腺相关病毒载体的性能［22］。

2　腺相关病毒载体在肿瘤基因治疗中的研究进展

AAV因其独特的生物学性状，与以往的几种病毒载体相比具有许多优点：低致病性、低免疫原性、易操作等，尤其是可长期稳定表达外源基因的特点能够弥补腺病毒载体只能短期表达的不足。由此，其已经广泛应用于多种肿瘤的基因治疗研究中。

2.1腺相关病毒载体与肺癌

广泛的研究表明新生血管的形成在实体恶性肿瘤的生长和侵袭中起关键作用，如果离开新血管系统的维持，肿瘤的直径只能保持在几毫米以内，因而抑制血管形成的治疗手段成为肿瘤治疗中很有前景的方案。血管形成是促进和抑制因子之间的平衡调控，利用腺相关病毒载体过表达血管生成抑制因子可以对抗肿瘤引起的血管生成，从而有效抑制肿瘤的增殖［23］。色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一个50 kDa分泌性糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，但没有蛋白酶抑制剂的活性。PEDF能够通过Fas/Fas-L途径激活上皮细胞的凋亡，并且打破促进和抑制血管生成因子之间的平衡，从而对肿瘤血管的生成产生强烈的抑制作用［24］。He［25］等人检测了AAV介导的肿瘤内表达PEDF对Lewis肺癌的抑制效果，将Lewis肺癌细胞用藻酸盐包被成微球后移植到C57BL/6小鼠背部，次日向小鼠注射AAV-PEDF并构建对照组，11天后取出微球离心测量上清的荧光强度，发现AAV-PEDF处理的小鼠荧光强度较于对照组组显著降低，并且发现AAV-PEDF处理的小鼠中微血管密度降低73％，同时肿瘤体积降低58％，从而说明PEDF能够显著抑制Lewis肺癌组织血管的形成，进而抑制肿瘤增殖。腺相关病毒载体表达PEDF的治疗手段在肺癌的治疗中有重要的意义和良好的前景。

2.2腺相关病毒载体与神经胶质瘤

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。由于肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，难以做到全部切除，治愈难度大，近期运用基因治疗作为替代治疗方案取得了令人期待的效果［26］。逆转录病毒载体和腺相关病毒载体是运用于神经胶质瘤治疗最主要的基因治疗载体。主流的基因治疗方法包括：把无毒的酶导入到肿瘤细胞内，该酶能够把药物前体转化为有毒的化合物从而杀死肿瘤细胞；通过病毒载体使特定毒素大量表达，该毒素针对神经胶质瘤细胞表面特定受体，从而使肿瘤细胞死亡；通过病毒载体使细胞因子如GM-CSF等过量表达，激活T细胞免疫或动员树突状细胞，增强免疫反应，达到治疗效果［27］。腺相关病毒载体因为其安全和高效性在对神经胶质瘤基因治疗中发挥重要作用。Zolotukhin等［28］为了提高腺相关病毒载体转导基因进入神经胶质瘤细胞的能力，设计出2种改善AAV的方案，其一是去掉AAV2衣壳表面暴露的酪氨酸残基，因为磷酸化的酪氨酸残基是遍在化的一个信号，去掉酪氨酸残基后减弱了蛋白酶体降解活性从而有利于病毒载体向细胞核定位，进而增强了基因转导效率；其二是ShH19，即改组的AAV2，部分序列是来自其他血清型的病毒。研究发现改变衣壳的腺相关病毒载体转导外源基因进入神经胶质瘤GL261细胞的能力显著增强，腺相关病毒载体在神经胶质瘤的基因治疗中发挥着重大作用，前景看好。

2.3腺相关病毒载体与胰腺导管腺癌

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是常见的胰腺肿瘤，是一种恶性程度高、诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年上升。运用腺相关病毒载体进行基因治疗，把治疗基因转导入PDAC细胞中，是目前治疗胰腺癌的一种很有前景的方法。通过修饰病毒衣壳表面，使其展示一种特异性结合网蛋白-1的多肽，从而使基因改造的AAV2载体能够特异性靶向PDAC细胞［29］。这种特异性结合网蛋白-1的多肽（plectin-1 targeting peptide，PTP）被插入到AAV2衣壳的环Ⅵ区域，Konkalmatt等人［30］检测了重组载体体内和体外实验的转导效果，发现AAV2-PTP相较于非胰腺细胞能够更好的靶向人类PDAC细胞，包括PANC-1、MIAPaCa-2、HPAC等胰腺细胞株。AAV-PTP对PANC-1肿瘤移植物的亲嗜性是其他组织的37倍左右。改造后的AAV载体并不整合入宿主的染色体，而是作为稳定的游离基因长期进行基因表达。综上所述，腺相关病毒载体介导的基因治疗在胰腺癌的治疗中具有相当的潜力。

2.4腺相关病毒载体与宫颈癌

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来其发病有年轻化的趋势。尽管宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降，但仍是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三个常见的恶性肿瘤［31］。LIGHT是肿瘤坏死因子超家族中的一种配体，能够在肿瘤位点构建淋巴样组织并且能招募初始T细胞进入肿瘤，显示出了强大的抗肿瘤活性，在肿瘤治疗中有很大的应用前景［32］。腺相关病毒载体由于其高转导效率和低免疫原性被选为LIGHT的转导载体。Maitituoheti等人［33］发现在体外AAVLIGHT能够刺激T淋巴细胞的增殖和活化，并且通过构建C57BL/6小鼠TC-1 CC动物模型，发现皮下注射AAV-LIGHT能够显著降低肿瘤的大小和重量，表明AAV-LIGHT能够通过活化细胞毒性T细胞和增强肿瘤位点的淋巴细胞浸润来起到抑制肿瘤生长的作用，腺相关病毒载体介导的基因治疗在宫颈癌的治疗中显示了巨大的应用前景。

2.5基因疫苗载体

基因疫苗是指将编码外源性抗原基因通过合适的载体系统导入人体或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，直接诱导机体产生免疫应答从而达到预防疾病的目的。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而到达预防疾病的目的。其中人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）腺相关载体疫苗已在人体进行了免疫试验。在利用腺病毒载体表达人疟原虫CS抗原蛋白进行免疫研究中证明，其免疫效果甚至比放射孢子体的免疫效果还要好［34］。尽管人源腺相关病毒在试验动物体内取得较好的免疫效果，但是在多数人不同程度的存在人腺相关病毒的中和抗体的情况下，这些中和抗体会阻碍腺相关病毒载体在体内有效地表达外源基因。怎样避免腺相关病毒特异性的中和抗体是目前腺相关病毒载体疫苗研究中的一个主要的问题［35］。

除此之外，其他表达转基因的腺相关病毒载体也显示出比较好的治疗效果。有报道称利用表达粒性巨噬细胞集落刺激因子的腺相关病毒载体治疗黑色素瘤的临床试验，显示了强大的抗癌效果［36］。病毒性肿瘤、致癌基因过表达引起的肿瘤能够表达诱导T细胞免疫反应的肿瘤抗原。但是许多肿瘤却可以规避有效的抗肿瘤T-细胞免疫反应［37］。研究表明，用腺相关病毒载体连续表达多个肿瘤抗原的CTL表位，具有很好的抗肿瘤活性。肿瘤组织选择性复制的腺相关病毒载体被用来表达抗肿瘤细胞因子激活物具有明显的抗癌效果［38］。

3　结论与展望

腺相关病毒载体是将天然存在的腺相关病毒经过基因工程改造后产生的一种基因载体。由于有众多的腺病毒种类，使得我们可以根据不同的需要来研究开发不同的腺相关病毒载体。可以根据需要改变病毒衣壳表面来改变腺病毒的宿主亲嗜性，制造出靶向定位的腺相关病毒载体，从而将载体靶向到特定的组织器官中来治疗人类各种疾病；也可以改变腺病毒基因组从而扩大载体容量，使腺相关病毒载体更好地为人类服务。随着研究的深入，腺相关病毒载体广泛用于基因治疗和基因疫苗载体。通过对载体的改造和所装载外源治疗基因的选择，对于攻克威胁人类健康的癌症和各种遗传性疾病具有潜在的应用价值。

尽管腺相关病毒载体在基因治疗和基因疫苗治疗等方面研究较多，但在临床运用上还存在问题［39］。重组的AAV是由待转导的真核基因和病毒衣壳构成的重组分子，不能编码任何病毒蛋白质，但重组的病毒衣壳仍与野生型病毒衣壳很相似，因此当暴露于机体免疫系统时仍然会激发针对核衣壳和外源基因的免疫反应［40］。相信随着病毒分子生物学技术和疫苗技术的不断发展，腺相关病毒载体疫苗和治疗药物必将会从研究走向临床应用，为人和动物的卫生健康服务。

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Adeno-associated virus（AAV）-based vector：a bridge towards tumor gene therapy

CHEN Xiusheng1，LIN Chuangzhen2，LEI Chuan1，QU Xiangming1，NIE Xin1，HU Ao1，CHEN Si1，DU Hongyan1★
（1.School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；2.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Adeno-associated virus（AAV）is a kind of human parvovirus that is defective and non-pathogenic.AAV vector，as the vector of gene-therapy，has superiority in long-term gene-correction and gene-therapy.AAV vector is considered to be the ideal vector to transfect target gene because of its mildly pathogenicity and easy to operation and now it has been widely used in different kinds of research on gene-therapy to neoplastic disease.Through improving its targeting and reducing its immunogenicity by reforming and optimizing the AAV vector，it is hopeful to provide new methods and measures to the research about gene-therapy of tumor.In this paper many researches on application of AAV vector in tumor gene therapy are summarized，which will be helpful for studies on tumor gene therapy.

Adeno-associated virus（AAV）；Gene therapy；Application；Research progress

国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA020205）；国家自然科学基金（81401920）；2013国家教育部博士点基金（20134433120020）；2013年国家级“大学生创新创业训练计划”项目（1212113058）；南方医科大学基础研究前期启动项目（QD2013N005）；广东省“大学生创新训练计划”（201412121094）

1.南方医科大学生物技术学院，广东，广州510515 2.南方医科大学第一临床医学院，广东，广州510515

杜红延，E-mail：gzduhongyan@126.com

注：陈秀生，林创珍为共同第一作者