热敏脂质体(TSL)的研究进展

丁昂昂(综述) 熊 屏△(审校) 陈亚珠

(1上海交通大学医学院附属第九人民医院超声科 上海 200011;2上海交通大学生物医学工程学院 上海 200240)

热敏脂质体(TSL)的研究进展

丁昂昂1(综述) 熊 屏1△(审校) 陈亚珠2

(1上海交通大学医学院附属第九人民医院超声科 上海 200011;2上海交通大学生物医学工程学院 上海 200240)

热敏脂质体(thermosensitive liposome,TSL)是一种常用的靶向抗肿瘤药物载体,与热疗联合应用时可使肿瘤药物在肿瘤部位达到较高浓度,增加对肿瘤细胞的杀伤作用,同时降低全身不良反应,具有良好的应用前景。不断改变脂质体膜材料组成,提高脂质体功能是当前研究的热点,该文就TSL的最新研究进展进行综述。

肿瘤; 热敏脂质体(TSL); 热疗

随着癌症发病率的逐年提高,化疗在临床中的应用也越来越广泛,目前化疗的药物多使用全身给药法,组织选择性低,会导致明显不良反应及肿瘤部位药物浓度不足。给药系统(drug delivery system,DDS)能相对靶向病变组织、器官、细胞,具有重要的临床实用意义。热敏脂质体(thermo sensitive liposome,TSL)就是这样一类新型的抗肿瘤药物载体,是脂质体靶向研究的热点之一,本文将主要论述TSL进行肿瘤局部治疗的研究进展。

TSL作用原理 肿瘤组织存在增强和滞留效应(enhanced permeability and retention effect,EPR)[1],即由于新生血管通透性较大、淋巴回流障碍等生理特征,纳米级给药载体TSL可选择性地蓄积在肿瘤区域。在正常体温下,TSL质膜呈致密的胶晶态,故其内包埋的药物很难扩散出来,起到药物储存库的作用;当随血液循环经过预先加热的靶组织时,只要达到质膜磷脂液晶态相变温度(transformation temperature,Tm),脂质体膜即从胶晶态过渡到液晶态,膜的流动性增大,对水和药物的通透性成几何级增长,脂质体内部包埋的药物大量扩散到靶器官中,在靶部位形成较高的药物浓度。

预先对靶组织进行加热即热疗,目前常用的热疗方式有:(1)射频消融(radiofrequency ablation,RFA),是一种局部治疗实体肿瘤的热消融手段,其原理是将射频电极插入组织内,当电流频率高到一定值时(>100 kHz),组织内带电荷的离子可运动摩擦生热(60～100 ℃),因此可直接毁损病灶,目前已单独应用于早期肝癌[2]、子宫肌瘤[3]等疾病的治疗;(2)高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU),体外分散发射的超声波能量较低,HIFU利用超声波的可汇聚性,将其聚焦于体内某一靶区,并将超声波声能转化为热能,对特定靶区进行加热,目前临床上常用的频率为0.8～3.5 MHz[4];(3)核磁共振引导下的高强度聚焦超声消融(MR guided HIFU ablation,MR-HIFU),为MRI联合HIFU技术,为近几年新兴的技术,可通过大量的MR相位图描绘靶区的温度分布,向超声控制单元反馈信息,提供靶组织的近实时温度值,再联合相控阵聚焦超声,对局部组织进行可控的无创性加热[5]。

TSL材料的发展 由于人体对温度的耐受性有限,TSL的基础材料多为相变温度低的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC)。最初,Yatvin等[6]使用DPPC和二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoyl phosphatidyl choline,DSPC)组成TSL,包裹新霉素和甲氨蝶呤,进行温度诱导给药。但是在Tm时,药物释放动力学相对缓慢,并且没有定量释放药物。不断优化脂质体的组成,提高脂质体的热敏释药特性,达到局部治疗的目的一直是研究的热点,主要包括以下几个方面:

提高稳定性 Li等[7]通过优化脂质成分和DSPE-PEG2000的含量(1～10 摩尔百分比)来改善质膜的稳定性。使用水相淬灭羧基荧光素(carboxy fluorescein,CBF)代表负载药物,体外荧光定量显示温度/时间依赖性的CBF释放量和TSL的血清稳定性。发现CBF释放量与DSPE-PEG2000含量成正比,但当DSPE-PEG2000含量≥6摩尔百分比时,出现生理温度下的药物泄露。当DSPE-PEG2000含量为5摩尔百分比时,42 ℃下,1 min内释放60%的药物,1 h时释放量几乎达到100%。并且使用共聚焦显微镜在植入人BLM黑色素瘤的背皮瓣窗口室模型中观察CF的体内释放情况,光学活体成像显示,41 ℃以上时,CF大量释放。

Needham等[8]在DPPC构成的脂质体中加入了溶血磷脂(溶血磷脂热敏脂质体,lysophosphatidic thermosensitive liposomes,LTSL),同传统TSL不同,在温热疗(41～42 ℃)下,LTSL可在几秒钟内定量释放阿霉素,膜稳定性及41 ℃左右时药物的释放速率也明显提高。Banno等[9]认为当MSPC(如1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂)含量为5%和10%时药物释放率较好。Celsion公司开发的多柔比星-TTRT-L(商品名ThermoDox®)即是一种LTSL,组成成分为DPPC∶MSPC∶DSPE-PEG2000(86∶10∶4,mol/mol),目前正进行肝癌的三期临床和乳腺癌胸壁复发的二期临床试验。

苄泽类表面活性剂为单酰基表面活性剂,末端为聚乙二醇,与MSPC和DSPE-PEG2000有相似的化学结构,Tagami等[10]将其加入DPPC脂质体中,替代MSPC和DSPE-PEG2000。发现在溶血活性及阿霉素热疗释放动力学方面,TSL的最佳搭配为DPPC/苄泽78(96∶4摩尔百分比)。苄泽脂质体的相变温度比LTSL低(41 ℃vs. 41.5℃),在释放动力学方面,比传统TSL快1.2～2倍,热疗40～42 ℃时,2.5 min内释放90%～100%的药物,且质膜性质稳定(同37 ℃时相同)。May等[11]将其称为超快热敏脂质体(ultrafast temperature sensitive liposome,uTSL),包埋不同的化疗药物—吉西他滨和奥沙利铂,这两种药物可溶于水但是细胞通透性较差,也得到相似的结论。

Hossann等[12]研究了4种不同组成成分的TSL,DPPC/DSPC/DPPGOG=50/20/30 (moL/moL)(DPPG2-TSL);DPPC/DSPC/DPPG2/DSPE-PEG2000=50/15/30/5 (moL/moL)(DPPG2/PEG-TSL);DPPC/P-Lyso-PC/DSPE-PEG2000=90/10/4 (moL/moL)(PEG/Lyso-TSL);DPPC/DSPC/DSPE-PEG2000=80/15/5 (moL/moL)(PEG-TSL)。4组均受血清成分的影响,且易感性与脂质体的组成有关。37 ℃的胎牛血清中,DPPG2-TSL比PEG/Lyso-TSL更稳定,因此DPPGOG的存在可提高质膜稳定性。他们认为蛋白质和胆固醇脂囊泡是TSL释药的介质,血清中蛋白成分(白蛋白、IgG等)不同,对不同成分脂质体稳定性的影响也不同。

提高血管靶向性 血管生成(angiogenesis),是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,可向增殖的肿瘤细胞提供氧气和营养物质,是肿瘤组织生长和转移的的关键。若化疗药物可以靶向肿瘤血管,阻碍此过程,则可抑制肿瘤组织的生长,达到抗瘤的目的。关于血管靶向脂质体,研究较多的是血管生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)[13]。Kim等[14]认为新生血管高表达整合素αvβ3,而环状精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸(cRGD)可与其结合,他们使用脂质薄膜水化法在DPPC TSL表面加入弹性蛋白多肽和cRGD,后又使用硫酸铵梯度法负载阿霉素,制成血管靶向的TSL,联合热疗后发现42 ℃和45 ℃时阿霉素的释放率分别为75%和83%,且流式细胞仪检测结果表明,过度表达整合素αvβ3的U87MG和HUVEC细胞的阿霉素摄取量也较高,证明其靶向性。

提高细胞靶向性 Dicheva等[15]在TSL的脂质双层中加入带电阳离子(阳离子TSL cationic circulation thermosensitive liposomes,CTL),使用流式细胞仪、活细胞成像、活体光学成像等方法,证明CTL在正常体温下性质稳定,可靶向定位血管内皮细胞和肿瘤细胞,并且在两个实体瘤的细胞模型中发现,加用热疗可促进细胞内外快速释放包埋的药物。Ho等[16]认为,CTL可能受到某种血浆蛋白的调控,才对血管内皮细胞有较强的亲和力。

免疫热敏脂质体(thermosensitive immunoliposome)即将某种抗体结合在TSL质膜上,该抗体可与靶细胞表面的抗原特异性的识别和结合,因此起到靶向定位的作用。Smith等[17]使用DPPC∶Mal-PEG2000-DSPE∶PEG2000-DSPE=89∶5.5∶5.5合成HER2-免疫TSL,靶向结合肿瘤组织中的抗HER2-抗体,体外研究证明HER2-免疫TSL有高度靶向性,可以作为乳腺癌治疗的纳米药物输送载体。

Negussie等[18]在TSL表面加入了天冬酰胺—甘氨酸—精氨酸配体(NGR),负载阿霉素,合成NGR-TSL (DPPC∶MSPC∶NGR-PEG2000-DSPE=85∶10∶5),可靶向结合CD13,纤维肉瘤和乳腺癌的体外研究表明NGR-TSL有良好的靶向性。近年来,一些具有细胞膜穿透作用的多肽,即细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP),作为一类能够高效携带外源分子转运到细胞内的载体工具成为目前的研究热点。它们可以有效地将大分子药物、蛋白类、核酸类、纳米颗粒、脂质体等导入多种哺乳动物细胞。Yang等[19]在最近的研究中将负载的药物改为细胞穿透肽—阿霉素耦合物。CPP-Dox/NGR-TSL理化性质好,粒径约90 nm,药物包埋率高(约95%),在10%的胎牛血清中稳定性良好,又可防止CPPs在非靶向部位被酶降解和丢失,发现同包埋游离阿霉素的NGR-TSL相比,可明显抑制裸鼠人纤维肉瘤移植瘤(HT-1080)的生长,抗瘤效果更佳。

提高循环时间 长循环热敏脂质体(long-circulation thermosensitive liposome,LTSL)通过将亲水性大分子镶嵌到TSL表面,可减少内皮网状系统(RES)的识别和摄取,延长体内的循环时间,PEG为常用的亲水性材料。但亲水性高分子材料的嵌入在一定程度上降低了脂质体的热敏性,Na等[20]对此进行了研究。弹性蛋白多肽(ELP)为一种热感应相变肽,含有赖氨酸残基,可与DSPE-PEG2000-NHS产生共轭键,他们使用ELP修饰聚乙二醇阿霉素脂质体膜,在血清中进行热疗时,发现合成ELP可逆转Tm(40 ℃),同非ELP修饰的脂质体相比,肿瘤细胞的药物摄取增加。

可视化给药 将磁性材料加入TSL的亲水性核或脂质双分子层中即合成磁性热敏脂质体(thermosensitive magnetoliposomes,TSM),可以在外加磁场的作用下随血液循环聚集到靶器官,通过交变磁场产热,释放负载的化疗药物,达到定向进行肿瘤热化疗的效果。Kulshrestha等[21]研究了同时包裹紫杉醇和Fe3O4的TSL,认为其有利于热疗和联合化疗。磁共振对比剂也是一种磁性材料,近几年,联合包裹化疗药物和MRI对比剂的TSM发展迅速。de Smet 等[22]研究了两种同时包埋阿霉素和[Gd(HPDO3A)(H2O)]的脂质体,发现[Gd(HPDO3A)(H2O)]的存在不会影响阿霉素的释放,且二者均在接近Tm时释放。TSM的意义在于可与MR-HIFU合用,在接近脂质双层相变温度(Tm)时,脂质体释放MRI对比剂,直接导致磁共振信号的改变,因此可进行病变组织药物的可视化和定量释放。Lorenzato等[23]研究了包埋超小超顺氧化铁磁性纳米粒子TSL,使用水浴或MR-HIFU进行热疗,加热前后MRI的信号和弛豫明显改变,认为TSM不但能进行肿瘤部位脂质体浓度的检测,也可以观察随温度升高TSM质膜的相位变化。

大小对于释药的影响 TSL的体积是否影响药物释放？Hossann等[24]认为,即使是较小的体积改变都会影响TSL的稳定性及释放能力,因此他们研究了TSL的大小对药物释放曲线的影响,使用DPPC/DSPC/DPPG250∶20∶30 (moL/moL) (DPPG2-TSL)和DPPC/P-Lyso-PC/DSPE-PEG200090∶10∶4 (moL/moL) (PEG/Lyso-TSL)组成的两种TSL,包埋荧光染料羧基、抗肿瘤药物或者MRI对比剂轧双胺,使用不同尺寸的聚碳酸酯过滤器,得到不同大小的TSL(50～200 nm)。研究发现,脂质体大小(50～200 nm)对Tm无影响,但是对体外释药性能有较大的影响(研究温度为30～45 ℃),二者成负相关;并且,在100～150 nm之间,TSL大小对PEG/Lyso-TSL的影响比DPPG2-TSL小。由于目前体内常用的脂质体大小为100 nm左右,因此在使用前对于TSL制剂的质量进行严格控制十分必要。

结语 脂质体的研究已从单一脂质体向多功能脂质体发展,稳定性、靶向性、长效性等问题逐步得到解决,大量实验研究表明改良的TSL有良好的临床前结果,其临床试验也已开始进行。局部热敏给药的概念已提出了30年,触发TSL的热疗方法也在不断改善,局部可控的无创性加热已成为可能,这提示了在不久的将来这种方法将应用于临床,提供一种新的微创、局部治疗癌症的选择。

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复旦大学领衔“脑科学协同创新中心”

在2015年3月14日举行的以“脑信息与人工智能”为主题的东方科技论坛上,上海市科委今年将率先启动“以脑科学为基础的人工智能”项目,组织科研人员开展以应用和产业为导向的协同创新,以期在新一轮科技大潮中占得先机。自2012年,复旦大学就牵头联合浙江大学、华中科技大学、同济大学、上海交通大学等十几所高校及中科院研究所,成立了“脑科学协同创新中心”,推进脑科学研究和转化应用,积极推进和参与“上海脑计划”的实施。

依托于复旦大学脑科学协同创新中心、脑科学研究院和医学神经生物学国家重点实验室建设的“精神药物成瘾和记忆机制”创新研究群体,近期通过了国家自然科学基金委员会组织的实施情况考核评估,成为复旦大学第1个获得第3轮共计九年期资助的创新研究群体。

该群体是在共同承担科研项目和长期合作研究中自然形成的神经科学研究创新群体。群体学术带头人为马兰教授,主要骨干有郑平、张玉秋、黄志力、杨振纲、禹永春等。在基金委创新群体项目的支持下,群体成员形成了团结默契的合作关系,为高水平科研成果的产出奠定了基础,充分体现了创新群体科学基金的宗旨和作用。在项目实施过程中,通过召开药物成瘾研究研讨会,组织神经发育和记忆沙龙,总结交流工作进展、酝酿和组织合作项目,邀请国内外学者访问等学术活动来开展群体内和国际合作。群体的合作论文已经发表在Nat Neurosci、PNAS、J Neurosci等刊物上,展现出良好的发展势头。

(复旦大学脑科学研究院)

Recent advances in the study of thermosensitive liposome (TSL)

DING Ang-ang1, XIONG Ping1△, CHEN Ya-zhu2

(1DepartmentofUltrasound,theNinthPeople′sHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011,China;2SchoolofBiomedicalEngineering,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

Thermosensitive liposome (TSL) is commonly deployed as an antitumor agent carrier,which can establish local high medicine concentrations at tumor sites and enhance killing effects on tumor cells,at the same time,decrease systemic side effects when associated with hyperthermia treatment,demonstrating gorgeous application prospects.Currently,changing the material composition of the liposome membrane,to improve the function of liposome is under intense investigation,this paper reviews the recent research status of TSL.

neoplasms; thermosensitive liposome (TSL); hyperthermia

国家自然科学基金(81272567)

R 730.53

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.021

2014-03-11;编辑:王蔚)

△Corresponding author E-mail:xiong_ping_xp@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81272567).