同步辐射衍射增强成像(DEI)技术检测离体人肝细胞癌(HCC)新生血管

李蓓蕾 张一秋 蔡 良 侯晓广 石洪成 袁清习 陈绍亮△

(1复旦大学附属中山医院核医学科 上海 200032;2中国科学院北京高能物理研究所 北京 100049)

同步辐射衍射增强成像(DEI)技术检测离体人肝细胞癌(HCC)新生血管

李蓓蕾1张一秋1蔡 良1侯晓广1石洪成1袁清习2陈绍亮1△

(1复旦大学附属中山医院核医学科 上海 200032;2中国科学院北京高能物理研究所 北京 100049)

肿瘤新生血管形成是实体肿瘤发生、发展过程中一个标志性的事件[1]。评价肿瘤血管生成传统的影像学方法包括血管成像技术CT血管造影(CT angiography,CTA)、磁共振血管造影(magnetic resonance angiography,MRA)、数字减影血管造影(digital subtract angiography,DSA)[2-3]等,然而其分辨率均不高。而同步辐射相位衬度成像(phase contrast image,PCI)结合高分辨率、高速成像的X射线CCD探测系统将微血管的分辨率大大提高[4-5]。目前主要的PCI技术有4种:干涉法(interferemetry)、衍射增强成像(diffraction enhanced imaging,DEI)、光栅相衬成像(grating based phase-contrast X-ray imaging,GB-PCI)和类同轴相衬成像(in-line phase contrast imaging,IL-PCI)。其中,DEI是利用分析晶体将X射线穿过样品时产生的透射光、折射光和散射光彼此分开,从而获得高衬度和高空间分辨率的图像[6-8]。张汐等[9-10]使用DEI技术结合分辨率为10.9 μm的CCD探测器,在无对比剂情况下即可以显示40 μm左右直径的肝血管。本研究旨在利用DEI技术进行高质量、大视野的无对比剂的人肝细胞癌(hepatocelllular carcinoma,HCC)标本新生血管成像。

标本准备 选用2011年6月至2011年7月复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科切除的HCC标本3例。术前未注射任何对比剂,术后离体HCC标本均常温浸泡在4%甲醛溶液中固定12 h,取出后清水冲洗,分层脱水,切片,厚度3～4 mm,准备DEI成像。成像前将标本充分干燥。本研究通过复旦大学附属中山医院回顾性临床和生物标本伦理委员会批准。

同步辐射成像 DEI试验在北京同步辐射装置(Beijing synchrotron radiation facility,BSRF)的4W1A束线X射线成像站。同步辐射X射线DEI成像装置见图1。储存环电子束能量2.5 GeV,光子能量范围为3～22 keV,光斑20 mm(H)×11 mm(V)。采用VHR-16 X射线CCD探测器(英国Photonic Science公司),像素尺寸7.4 μm×7.4 μm,像素阵列4 872×3 248,可根据样品尺寸选取成像区域。本实验选择X射线能量为12 KeV,样品探测器距离0.3 m,曝光时间的选取根据尽可能使图像占据整个动态范围而不致饱和的原则(峰位曝光时间较短)。实验中,首先改变分析晶体与单色晶体之间的夹角,测量X射线反射率随双晶体夹角变化的函数曲线——摇摆曲线,然后将样品放置于两晶体之间的光路上,分别在摇摆曲线的峰位和反射率为50%的左、右半腰进行成像。

图1 BSRF 4W1A束线实验线站DEI示意图Fig 1 Schematic DEI experimental set-up at 4W1A beamline of BSRF

图像处理分析 应用Matlab 2012b软件(美国MathWorks公司)获得表观吸收图像和表观折射图像[11]。

使用Image Pro Plus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司)对最细血管直径进行测量。测量血管直径时,垂直于血管长轴画一直线,由灰阶变化曲线的半高宽距离乘以最小分辨率计算(图2)。由2位医师分别进行测量,将测得的最细血管的平均值作为最终结果。

图2 血管直径测量方法Fig 2 Method for calculating the vessel diameter

病理学分析 标本经4%甲醛溶液固定、石蜡包埋、4 μm厚度连续切片,进行HE常规染色。再用抗CD34抗体(C-18,美国Santa Cruz公司)进行免疫组化分析,评价肿瘤新生血管[12]。

DEI结果 DEI成像结果中,我们可以看到肿瘤呈膨胀性生长,边界清晰,肿瘤边缘或周围可见较粗大的血管受压呈弧形移位;瘤内微小血管较丰富,分布杂乱无章,形态无规则,测得的最细血管直径约为25 μm。在摇摆曲线不同位置记录的HCC图像的差异显著。在摇摆曲线峰位,即分析晶体和单色器晶体的衍射面完全平行时,采集的峰位图像(图3A)是滤除了散射吸收衬度和消光衬度的叠加像,图像的清晰度比较好,能大致显示肿瘤的轮廓及纤细的血管结构。当分析晶体的衍射面偏离摇摆曲线峰位,X射线穿过样品时产生的微小折射将改变其经分析晶体的强度,从而产生折射衬度。将分析晶体调节到摇摆曲线低角端和高角端最陡峭的点即左、右半腰处时,穿过样品后偏离的X射线反射率为50%,可以获得折射衬度与吸收衬度叠加的最大衬度的图像(图3C、D),显示的血管边缘以及血管与血管之间、癌与癌旁组织之间的位置关系要明显优于峰位图像。此外,还可以显示肿瘤内部结节样癌巢的结构特征。将边缘效应相反的左、右半腰图像叠加在一起,获得含有吸收和消光信息的表观吸收图像(图3B)。尽管图像中可以看到肿瘤的边界及瘤内外的血管分布,但整个图像的分辨率远不如峰位像。将左、右半腰图像相减,获得只含有折射信息的折射图像(图3E)。折射图像和其他在摇摆曲线各个部位获得的图像相比,显示了最高的衬度。图像中,肿瘤边缘和瘤内外血管的更清晰、空间感更强,呈现强烈的浮雕效果。

图3 人HCC标本中血管微观形态的DEI成像结果Fig 3 DEI images of detailed appearances of blood vessels in local area of human hepatocelluar carcinoma

肿瘤标本HE染色和CD34免疫组化光学显微图像见图4。HE染色:癌组织与正常肝脏分界明显,癌巢内可见坏死灶,间质中见弥漫分布粗细不均的新生血管,异常扩张的大血管和裂隙状的新生血管并存。CD34阳性染色主要位于血管内皮细胞膜和胞质,肿瘤组织的微血管密度显著高于癌旁组织。着色的肿瘤新生血管分布、形态和排列具有不均一性,形态失常,多为条索状,或是管壁极薄的有腔血管,管腔粗细不均。

图4 肝细胞癌标本HE染色和CD34免疫组化光学显微图像 (×4)Fig 4 The optical microscope image of HE staining and CD34 immunoche mistry of HCC (×4)

讨论 HCC是我国常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率均位列恶性肿瘤第2位[13]。HCC是典型的多血管恶性肿瘤,肿瘤细胞的无节制性生长和远处转移都是建立在肿瘤新生血管形成的基础上的[1]。因此,早期显示这些微血管的改变,对HCC的早期诊断和治疗都具有重要临床意义。

当X射线穿过物体时,其相位因为样品各部分的折射率不同而发生改变。PCI即是利用X射线在不同组织折射率的差异进行成像,与X射线的吸收无关,因此可以将传统X射线吸收成像无法显示的弱吸收组织(如血管)的分辨率大大提高至微米量级[6]。无对比剂血管PCI的原理是基于血液红细胞内的血红蛋白含有的大量铁原子,其比重和周围的组织不同而可以导致相位对比的改变[9]。此外,随着样品在空气中暴露的时间的延长,以及成像时X线和样品相互作用的产热作用,样品脱水干燥,空气取代了样品血管中的水分,造成血管腔和管壁之间相位对比差异更加明显,可见的血管数目、衬度和分辨率均增加[14]。

DEI对组织的边界有很强分辨能力,当分析晶体设置到摇摆曲线不同的位置时,对肿瘤、血管及其交界面的敏感性不同。将在摇摆曲线的左、右半腰处位置获得的图像相减得到的折射图像的衬度加倍,使得血管突显出来,是最适合进行血管成像的[10-11]。本研究应用DEI方法,选用分辨率为7.4 μm的CCD探测器,在没有对比剂的情况下显示了肝癌明显的占位效应,周围或边缘血管受压弧形移位,肿瘤内部分布杂乱无章,形态无规则的微小血管,测量得到的肿瘤血管最小直径约为25 μm,并显示了癌巢的结节样形态特征。这是临床常用 CTA、MRA、DSA所不及的[2-3]。而且,随着CCD探测器分辨率的提高,可以显示更细直径的肿瘤血管。但是值得注意的是,折射图像需要在摇摆曲线的两侧半腰处各获得一幅图像后,再进行图像处理而获得,因此必然要进行2次曝光,这就造成了辐射剂量的加倍。此外,由于DEI图像包含了传统X射线成像可以显示的和无法显示的结构,图像立体感强,使得其与传统影像学的成像结果不同,增加了DEI图像解释的难度[15]。例如,本研究获得的图像可以显示很多数十微米的分布杂乱无章,形态无规则的树枝状结构以及更加细小的网状结构,但是由于没有使用高对比度血管对比剂,我们尚不能确定这些结构都是血管,或是其中同时存在由于肿瘤坏死而出现的裂隙。两者的鉴别有待于进一步的研究。总之,本研究通过同步辐射DEI技术进行无对比剂条件下离体人HCC 标本肿瘤新生血管显像,获得了较满意的图像。

同步辐射; 衍射增强成像(DEI); 肝细胞癌(HCC); 肿瘤新生血管

[1] Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,14(5):646-674.

[2] Villablanca JP,Rodriguez FJ,Stockman T,etal.MDCT angiography for detection and quantification of small intracranial arteries:comparison with conventional catheter angiography[J].AJRAmJRoentgenol,2007,188(2):593-602.

[3] Wang H,Zheng LF,Feng Y,etal.A comparison of 3D-CTA and 4D-CE-MRA for the dynamic monitoring of angiogenesis in a rabbitVX2 tumor[J].EurJRadiol,2012,81(1):104-110.

[4] 陈绍亮,张汐,彭屹峰,等.同步辐射相位衬度成像医学应用初探[J].物理,2010,39(11):765-769.

[5] Hu JZ,Wu TD,Zeng L,etal.Visualization of microvasculature by x-ray in-line phase contrast imaging in rat spinal cord[J].PhysMedBiol,2012,57(5):N55-N63.

[6] Zhou SA,Brahme A.Development of phase-contrast X-ray imaging techniques and potential medical applications[J].PhysMed,2008,24(3):129-148.

[7] Zhang L,Luo S.Micro soft tissues visualization based on x-ray phase-contrast imaging[J].OpenMedInformJ,2011,5(Suppl 1):19-25.

[8] 汪敏,胡小方,伍小平,等.同步辐射X射线衍射增强CT方法研究[J].光子学报,2006,35(10):1597-1601.

[9] 张汐,陈绍亮,杨欣荣,等.同步辐射相位对比X线成像技术的初步研究[J].中华放射医学与防护杂志,2009,29(3):317-320.

[10] Zhang X,Yang XR,Chen Y,etal.Diffraction-enhanced radiography of various mouse organs[J].AJRAmJRoentgenol,2010,195(3):545-549.

[11] 赵涛,胡春红,李辉,等.基于衍射增强的肝脏图像的信息分离与微细血管重建[J].自然科学进展,2008,18(10):1151-1156.

[12] Chebib I,Shabani-Rad MT,Chow MS,etal.Microvessel density and clinicopathologic characteristics in hepatocellular carcinomawith and without cirrhosis[J].BiomarkInsights,2007,2:59-68.

[13] Chen JG,Zhang SW.Liver cancer epidemic in China:past,present and future[J].SeminCancerBiol,2011,21(1):59-69.

[14] Zhang X,Liu XS,Yang XR,etal.Mouse blood vessel imaging by in-line x-ray phase-contrast imaging[J].PhysMedBiol,2008,53(20):5735-5743.

[15] 彭屹峰,陈云燕,田净丽,等.比较同步辐射衍射增强与同轴技术小鼠肾脏成像[J].中国医学影像技术,2010,26(11):2027-2029.

[16] Preusser M,Heinal H,Gelpi E,etal.Histopathologic assessment of hot-spot microvessel density and vascular patterns in glioblastoma:Poor observer agreement limits clinical utility as prognostic factors[J].Cancer,2006,107(1):162-170.

国家重点基础研究发展计划项目(2010CB834305)

R 812

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.024

2013-12-10;编辑:段佳)

△Corresponding author E-mail:liangwen2@yeah.net