溺水尸体硅藻检验的研究进展

孙丞辉，王彪，李正东，秦志强

（1.上海市公安局奉贤分局刑侦支队，上海 201400；2.深圳市人民医院法医临床司法鉴定所，广东深圳 518020；3.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063）

·综述·

溺水尸体硅藻检验的研究进展

孙丞辉1，王彪2，李正东3，秦志强3

（1.上海市公安局奉贤分局刑侦支队，上海 201400；2.深圳市人民医院法医临床司法鉴定所，广东深圳 518020；3.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063）

判断水中尸体是生前溺水或是死后抛尸，以及高度腐败尸体的死因鉴定是法医学实践中的难点问题，硅藻检验是鉴定溺水死亡的重要辅助方法。本文综述了近年来硅藻检验技术的发展情况，阐述了法医学硅藻检验技术的研究进展，以及其在法医学领域的应用价值。

法医病理学；硅藻类；综述[文献类型]；溺水

溺死是法医学实践中的常见案件类型，亦是法医学检验的难点问题之一。在检案实践中，判断水中尸体是生前入水溺死还是死后抛尸入水，以及落水地点等情况时，硅藻的实验室检查尤为重要[1]。虽然法医学界目前对体内硅藻的检查结果仍然存在争议，如部分学者认为硅藻在自然环境中分布广泛，且提取过程中易受污染，可能出现假阳性和假阴性结果，影响硅藻检验在溺死鉴定中的价值[2-3]，然而在国内外法医学实践中，肺、肝、肾、骨骼及血液硅藻检测仍是溺水死亡首选的辅助指标，在某些高度腐败尸体中甚至成为关键证据。硅藻自1904年由Revenstorf[4]首次在溺死尸体肺中检出后，逐渐成为溺水死亡诊断的重要工具，之后，Incze[5]于1942年成功从血液和实质器官中检出硅藻，Timperman[6]基于大量溺死案例对法医学硅藻检验方法的有效性进行了验证，为硅藻检验广泛用于法医学溺水诊断奠定了基础。溺死尸体硅藻检验的相关研究主要集中于溺水尸体器官组织中是否存在硅藻、检出硅藻的种类等法医学关注的议题，但长期以来硅藻检验方法的研究进展较为缓慢，近年随着生物科学领域技术方法的突飞猛进，硅藻检验方法又开始成为研究的热点之一。目前常用硅藻检验基本上可分为基于形态学观察方法、基于DNA序列的分子种属鉴定方法以及基于硅藻化学元素组成差异的鉴定方法等类型[7]。本文对近年来国内外硅藻实验室检查方法以及结果评价的最新研究进展进行综述，为法医学水中尸体硅藻的检验提供参考。

1 硅藻检验方法

1.1 基于形态学特征观察的硅藻检验方法

硅藻种类繁多，共同特征是细胞壁中含有不易被破坏的含水硅酸盐成分，在浓酸中煮沸或高温烧灼均不会发生明显破坏，基于这一特征，通过对提取的器官组织进行破坏后可留下硅藻，经显微镜形态学观察

确定是否存在硅藻。该类方法因操作简单、仪器要求低，因而在检案中得到了广泛的研究与应用，在法医学硅藻检验中发挥着较大的作用。这类检验方法主要包括化学消化法和物理破坏法。

化学消化法通过强酸消化、离心富集硅藻以及光学显微镜观察等步骤获取硅藻，该方法由于具有消化完全、操作简单、成本较低等优点，是目前最常用的硅藻检测方法。李棨等[8]应用传统硝酸消化-离心方法对407例水中尸体进行硅藻检验，结果发现阳性例数达372例，说明该方法检出率较高，同时经动物实验[8]证明，在淡水中溺死兔子的器官中可检出大量硅藻。上述研究表明，传统的强酸消化法对判断溺水死亡案件具有实用性，但存在环境污染大、易破坏硅藻外壳等不足，存在假阴性可能，在实际应用中存在一定限制[9]。因此，如何环保、快速、高效地检出硅藻成为研究的热点。Fucci等[10]发现过氧化氢消解较强酸消解效果更佳，软组织破坏更彻底，硅藻检出率更高，是目前较新的化学消化硅藻检出方法。李向阳等[11]应用硝酸-过氧化氢-微波消解法，经真空抽滤及扫描电镜分析，使硅藻检出率得到提高，且扫描结果清晰易辨认；Zhao等[9]也比较了传统硝酸破机法与新型的微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描（microwave digestionvacuum filtration-automatic scanning electron microscope，MD-VF-AutoSEM）法的检出效率，结果示MDVF-AutoSEM法较传统方法检出效率高，但由于该检测方法过于灵敏，在生前溺水和死后入水的兔肺中均检出硅藻成分，因此应用该方法单独检出肺中硅藻不适宜直接作为判断溺死的依据。Kakizaki等[12]采用了改进的快速酶消解法，应用蛋白酶K试剂盒、组织裂解液试剂盒以及5 mol/L盐酸共同消解组织，这种方法组织需要量较少（1 g），较传统酶消解法消解时间短（3 h），对环境更加友好，硅藻破坏较少，在样本较少以及快速筛查情况下有较大应用价值。此外，基于传统方法应用离心法或真空抽滤法分离硅藻与组织消化液常有组织残渣干扰硅藻观察的情况，Seo等[13]提出利用硅藻细胞膜对DNA的结合活性，使用带有磁粉的γDNA捕获消解液中的硅藻细胞，然后应用离液序列离子液分离和纯化硅藻的方法，该分离方法相比离心法及真空抽滤法拥有更高的分离纯化率，值得进一步研究。

物理破坏法常见的有焚灼法及硅胶梯度离心法。焚灼法将检材加热灰化，用硝酸消解后加水过滤镜检，但该方法存在电灰化炉不够普及、灰化时间长、温度和时间控制较难等问题，目前应用和研究均较少见[14]。硅胶梯度在组织匀浆化过程中对硅藻破坏较大，检出率不高，故在实际应用中也存在限制。

目前硅藻检验应用最普遍的方法仍是基于强酸消化法的形态学检验方法，因试剂容易制备、操作流程易于规范，结果评价较客观等因素，故在法医学实践中应用广泛。针对其检材消耗量较大、硅藻易破坏等不足以及存在环境污染等安全隐患，微波消解法、酶消化法以及基于带磁粉的γDNA分离硅藻技术等可提高硅藻检出率，相关研究对完善基于形态学观察的硅藻检测技术具有重要作用。同时，显微镜下观察和检出硅藻与鉴定人检案经验密切相关，因此开发能够自动扫描与识别硅藻的系统对推广硅藻检验技术有着重要作用。近年来Wen等[15]基于扫描电镜自动扫描的图像，开发图像识别算法，从扫描数据中提取硅藻图像，自动对硅藻进行定性和定量分析。上述方法及系统的引进，有利于提高传统基于形态学特征的硅藻检验结果的可靠性，减少和避免假阳性和假阴性结果，有助于进一步提高法医学硅藻检验结果科学性和有效性[16]。

1.2 基于DNA序列的分子硅藻检验方法

分子生物学的发展为硅藻检验开辟了新的思路和方法，相对于传统的化学消化法，应用DNA基因序列检测硅藻的灵敏度更高，操作更简单，且结果可控，在硅藻检测中得到了广泛的研究。目前，以小核糖体亚单位编码基因（16S rDNA）研究硅藻检测最为热门。原核生物的16S rDNA中含有数个可变区，其信息量丰富，可为不同藻类的鉴别提供大量信息，是硅藻检测的理想标记。Nübel等[17-18]从环境水样中扩增16S rDNA片段，结合变性梯度凝胶电泳技术进行硅藻的群落指纹分析，分辨不同环境、不同时间、不同水域的硅藻群落特点。何方刚等[19]应用Nübel设计的引物进行水中藻类分析，发现该方法不仅有助于溺死的定性诊断，亦可用于溺水地点的推断。李鹏等[20]建立PCR法扩增16S rDNA片段检测蓝藻、硅藻及绿藻以诊断溺死，在生前入水死者肺中硅藻检出率达100%，死后入水死者肺中亦有硅藻检出，结合其他器官的检测结果，其检测灵敏度高，具有较好的应用前景。韩军鸽等[21]对比了硝酸消化法与PCR扩增16S rDNA基因法，结果发现，硝酸消化法较PCR扩增法用时短，两者在肺组织中硅藻检出率相同，而在肝、肾中PCR方法检出率更高，相比于硝酸消化法，PCR方法所需检材更少，信息量更多，硅藻种属分辨更容易。

Větrovsk伥等[22]认为，16S rDNA基因在结构和功能上较蛋白质编码基因保守，因此，用16S rDNA基因鉴定生物种群并不一定能够确保准确性。余政梁等[23]应用聚合酶链反应-变性高效液相色谱（polymerase

chainreaction-denaturedhighperformanceliquid chromatography，PCR-DHPLC）法检测硅藻特异的核糖体小亚基（ribosomal small subunit，SSU）基因，其检出率较16S rDNA片段更高，能直接检出硅藻，结果更具特异性，与微波消解-扫描电镜法相比，亦存在明显优势。2015年Rutty等[16]应用实时PCR法以及标记探针检测可疑溺死尸体中的水生藻类的DNA，在16例可疑溺水尸体中检出12例存在水生浮游生物，在4例非溺水死亡案例中未检出藻类DNA，但发现在尸体存在明显损伤的情况下，藻类也可直接进入体内器官如肝、脾等，造成假阳性结果。总之，以上研究表明，以PCR扩增为基础的硅藻DNA检测方法拥有快速、高通量的特性，对于溺水死亡案例的诊断有明显的辅助作用。

基于DNA的分子硅藻检验方法，对人员培训、实验室维护及操作规范等要求较高，在基层法医中普及应用较困难。同时，硅藻基因检测不依赖于硅藻形态和理化特征，灵敏度和特异性高，可快速鉴定硅藻种属，用于比对水中与尸体中硅藻种属，筛查溺水地点具有重要作用。此外，分区域检测不同水域的硅藻种属，可构建硅藻的不同水域的种属分布地图，对案件侦破具有一定的促进作用。因此，对硅藻进行特异性基因序列的检测，将在溺水尸体硅藻检验中具有一定的研究价值和应用前景。

1.3 基于硅藻化学成分组成差异的检验方法

核磁共振波谱法研究原子核对射频辐射的吸收，电感耦合等离子体质谱法是对不同质荷比的离子进行分离记录，上述方法可对各种生物大分子和无机物成分的结构进行定性、定量分析。应用核磁共振波谱法结合电感耦合等离子体质谱法可对不同种属的硅藻进行辨别和分类，结合液相色谱-质谱联用技术可有效分辨硅藻成分，可在无组织前处理的前提下，有效分辨骨髓组织与硅藻颗粒。Frenkel等[24]应用核磁共振波谱法与电感耦合等离子体质谱法观察羽纹目硅藻的信息素释放过程，并可应用于硅藻检测与种属分类。La Vars等[25]应用固体核磁共振硅谱以及衰减全反射红外光谱技术对不同浓度盐溶液中的两种硅藻进行检测，并对硅藻外壳硅、氧元素成分变化进行连续监测，结果示硅藻外壳构成成分与盐溶液浓度高度相关，不同硅藻的敏感性不同。Wisser等[26]亦应用上述方法研究硅藻外壳中生物大分子与生物矿化硅间的相互作用关系。上述研究表明，核磁共振波谱法与电感耦合等离子体质谱法可直接应用于硅藻外壳化学成分的检测，且检出效率较高，可用于法医学研究和实践。

原子力显微镜技术源于扫描电镜技术，所提取样品可直接用显微镜进行观察、处理，该方法的优势在于可直接在液体或其他介质中进行硅藻检测，无前处理程序，且其扫描范围能够覆盖最大的硅藻，并能将硅藻外壳化学成分细节完全呈现。相较于核磁共振法，该方法可对任何检材的表面进行扫描，得到可能的硅藻化学成分构成图像，并能够获取硅藻表面元素构成的三维数据，使检测数据更加精确。Gebeshuber等[27]首次应用原子力显微镜检测了活体的硅藻，Pletikapi＇c等[28]利用该方法检测硅藻有机成分与硅成分结合过程，以及硅藻外壳的形态特征等。原子力显微镜如今已应用于对硅藻外壳矿化过程、细胞膜超微结构研究、细胞膜的微观生物力学研究以及硅藻细胞膜外基质的黏附参数研究等，相应的研究成果可直接应用于法医学硅藻检测以及种属分类等[29]。

2 法医学硅藻检验研究展望

对于溺水尸体，大体及组织学的法医学特异性检查结果因尸体腐败自溶而破坏消失，因此硅藻检验在溺死鉴定中仍扮演非常重要的角色，研究者们在实践中对硅藻检验在生前溺水与死后抛尸、水中高度腐败尸体死因鉴定方面的重要意义予以了充分肯定。目前，硅藻检验技术还需要不断地完善，基于现有技术、方法及流程的完善与标准化是溺水尸体硅藻检验的研究重点：检材采集的标准化，防止检材交叉污染；硅藻提取需满足高效、安全、环保、破坏率低及回收率高的要求，提高检出率和成功率；在硅藻定量检验方面，若进一步研究将形态学观察方法、基因序列方法以及硅藻自动扫描、识别方法等综合应用，有望构建硅藻自动化识别及计数系统等，使硅藻检测更加快捷，从而更好地服务于法医学实践[30]。

[1]赵子琴.法医病理学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2009.

[2]Vieira DN.Forensic medicine--from old problems to new challenges[M].Rijeka，Croatia：InTech，2011.

[3]Saukko P，Knight B.Knight’s forensic pathology[M]. 3rd ed.Arnold，London：CRC Press，2004.

[4]Revenstorf V.Der Nachweis der aspirierten Ertr覿nkungsflüssigkeit als Kriterium des Todes durch Ertrinken[J]. Vjschr Gerichtl Med，1904，27：274-299.

[5]Incze G.Fremdk觟rper im blutkreislauf ertrunkener[J]. Zentralbl Allg Pathol Anat，1942，79：176.

[6]Timperman J.The diagnosis of drowning.A review[J]. Forensic Sci，1972，1（4）：397-409.

[7]Rohn EJ，Frade PD.The role of Diatoms in medico-legal investigationsⅡ：a case for the develop-

ment and testing of new modalities applicable to the diatom test for drowning[J].The Forensic Examiner，2006，15（4）：26-35.

[8]李棨，马开军，张晓东，等.水中尸体肺组织硅藻检验与死因分析[J].法医学杂志，2011，27（5）：324-326，333.

[9]Zhao J，Wang Y，Wang G，et al.Application of the microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy method for diatom detection in the diagnosis of drowning[J].J Forensic Leg Med，2015，33：125-128.

[10]Fucci N，Pascali VL，Puccinelli C，et al.Evaluation of two methods for the use of diatoms in drowning cases[J].Forensic Sci Med Pathol，2015：601-605.

[11]李向阳，赵建，刘超，等.溺死及死后入水兔肺组织中硅藻分布[J].法医学杂志，2014，30（2）：81-84，87.

[12]Kakizaki E，Yukawa N.Simple protocol for extracting diatoms from lung tissues of suspected drowning cases within 3h：First practical application[J].Forensic Sci Int，2015，251：179-185.

[13]Seo Y，Ichida D，Sato S，et al.An improved method for the diatom test utilizing DNA binding ability of silica[J].J Forensic Sci，2014，59（3）：779-784.

[14]徐三明，侯绪东，付建伟.高温灰化消解法检验硅藻的研究[J].河南公安高等专科学校学报，2005，（1）：79-80.

[15]Wen J，Hu S，Liu C，et al.Automatic scanning by scanning electron microscopy：the first step towards automation of forensic diatom test[C]//Biomedical Engineering and Biotechnology（iCBEB），2012 International Conference on，Macau，2012.

[16]Rutty GN，Bradley CJ，Biggs MJ，et al.Detection of bacterioplankton using PCR probes as a diagnostic indicator for drowning；the Leicester experience[J]. Leg Med（Tokyo），2015，17（5）：401-408.

[17]Nübel U，Garcia-Pichel F，Muyzer G.PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria[J]. Appl Environ Microbiol，1997，63（8）：3327-3332.

[18]Nübel U，Garcia-Pichel F，Kühl M，et al.Quantifying microbial diversity：morphotypes，16S rRNA genes，and carotenoids of oxygenic phototrophs in microbial mats[J].Appl Environ Microbiol，1999，65（2）：422-430.

[19]何方刚，黄代新，刘良，等.PCR-DGGE法检测浮游生物16S rDNA在溺死鉴定中的应用[J].中国法医学杂志，2008，23（4）：234-237.

[20]李鹏，徐曲毅，陈玲，等.检测藻类16SrDNA特异性片段在溺死诊断中的应用[J].南方医科大学学报，2015， 35（8）：1215-1218.

[21]韩军鸽，王程宝，李兴彪，等.硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的比较[J].法医学杂志，2013，29（5）：356-359.

[22]Větrovsk伥T，Baldrian P.The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses[J].PLoS One，2013，8（2）：e57923.

[23]余政梁，刘超，胡孙林，等.PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用[J].中国法医学杂志，2013，28（6）：457-460.

[24]Frenkel J，Gillard J，Vyverman W，et al.Investigation of the mating pathway in the diatom Seminavis robusta：XXII International Diatom Symposium[C]. Aula Acaolemica，Ghent，Belgium，2012：45.

[25]La Vars SM，Johnston MR，Hayles J，et al.29Si {1H}CP-MAS NMR comparison and ATR-FTIR spectroscopic analysis of the diatoms Chaetoceros muelleri and Thalassiosira pseudonana grown at different salinities[J].Anal Bioanal Chem，2013，405（10）：3359-3365.

[26]Wisser D，Brückner SI，Wisser FM，et al.1H-13C-29Si triple resonance and REDOR solid-state NMR-A tool to study interactions between biosilica and organic molecules in diatom cell walls[J].Solid State Nucl Magn Reson，2015，66-67：33-39.

[27]Gebeshuber IC，Kindt JH，Thompson JB，et al. Atomic force microscopy study of living diatoms in ambient conditions[J].J Microsc，2003，212（Pt 3）：292-299.

[28]Pletikapi＇с G，Berquand A，Radi＇с TM，et al.Quantitative nanomechanical mapping of marine diatom in seawater using peak force tapping atomic force microscopy1[J].Journal of Phycology，2012，48（1）：174-185.

[29]Luís AT，Hlúbiková D，Choquet P，et al.Atomic force microscopy（AFM）application to diatom studies：review and perspectives：XXII International Diatom Symposium[C].Aula Acaolemica，Ghent，Belgium，2012：190.

[30]潘国男，吕凌.溺死法医学检验鉴定方法评估与展望[J].中国司法鉴定，2009，（4）：67-70.

Progress on Diatom Test in Drowning Cases

SUN Cheng-hui1,WANG Biao2,LI Zheng-dong3,QIN Zhi-qiang3
（1.Criminal Investigation Detachment,Fengxian Branch of Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 201401,China;2.Clinic Forensic Medicine Judical Appraisal Firm,Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen 518020,China;3.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China）

In drowning cases,it is difficult to judge whether the deceased died from drowning or throwing into the water after killed or identificate the cause of death of the decomposed corps in forensic practices.The diatom test is still considered as the important assistant evidence in drowning cases.This paper reviews research progress on technologies in recent years of forensic diatom test,and the application value of the new developing approach in the field of forensic medicine.

forensic pathology;diatoms;review[publication type];drowning

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.012

1004-5619（2015）06-0462-04

2015-10-13）

（本文编辑：邹冬华）

孙丞辉（1982—），男，主检法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：diego_sun@sina.com

秦志强，男，主任法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：qinzq@ssfjd.cn