直肠癌血清多肽谱诊断模型的建立及其应用效果▲

谢志葵 陈锐锋 李国文

(1 南方医科大学第五附属医院内科，广州市 510900，E－mail:xiezhikui2014@163.com;2 广东从化市街口街社区卫生服务中心，广州市 510900)

结直肠癌是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，近几年其发病率呈逐年上升的趋势，发病也呈现年轻化的趋势。结直肠癌的临床症状不明显，且发展较快，大多数患者在确诊时已经处于中晚期，不利于治疗，因此尽早准确诊断结直肠癌可为治疗争取更多的时间。目前临床上诊断结直肠癌的方法所需时间较久，费用较高，仪器设备也比较昂贵。建立一种快速且具有高灵敏性的结直肠癌检测方法具有很高的必要性。蛋白质组学是某种生物或某种细胞在特定时间表达的全部蛋白质，为临床医师提供了新的肿瘤早期诊断和预后评估的手段［1－4］。本文旨在建立人结直肠癌血清蛋白标记物诊断模型，并分析其诊断直肠癌的效果，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012 年6 月至2014 年6 月在南方医科大学第五附属医院就诊的直肠癌患者119 例(直肠癌组)，均经过直肠癌镜和病理检查确诊，均无其严重的并发症，诊断标准参照文献［5］。其中男65 例，女54 例;年龄25 ～76(45.9±6.7)岁;低分化腺癌53 例，中分化腺癌49 例，黏液腺癌14 例，印戒细胞癌3 例。术后病理结果显示有淋巴结转移患者29 例，其中N1期12 例，N2期17 例，无淋巴结转移(即N0期)患者90 例。均行直肠癌根治手术治疗。同期在南方医科大学第五附属医院体检健康者127 例为对照组，其中男69 例，女58 例，年龄28 ～73(44.6±7.2)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。均排除影响血清蛋白质含量的其他相关性疾病。

1.2 仪器与试剂 高速离心机、酶标仪(Multiskan MK3，德国Thermo 公司);4℃冰箱(中国海尔公司);－80℃冰箱(德国西门子公司);微量移液器(法国Gilson 公司)。血清癌胚抗原(CEA)检测试剂盒(江苏碧云天)，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)等购自美国Sigma公司;鼠抗人EHD 家族蛋白2(EHD2)抗体、鼠抗人1－异戊烯半胱氨酸氧化酶(prenylcysteine oxidase1，Pcyox1)抗体、鼠抗人激肽原1(kininogen－1，KING1)抗体、羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体购自美国Abcam 公司;酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 样品采集:采集术前清晨直肠癌组与对照组患者空腹静脉血3 ml，加入适量枸橼酸钠抗凝剂，将全血放置在4℃冰箱中1 h，然后4 000 r/min，离心20 min，取血清，置于－80℃冰箱中保存。

1.3.2 液体芯片飞行时间质谱检测:取血清样品1 μl与10 μl 基质α－氰基－4－羟基肉桂酸混匀，取1 μl 混合液点在Anchorchip 靶板(美国Bruker 公司)上，每个样品分别点3 个靶点以做3 次重复。室温干燥后将靶板放入质谱仪以线性模式运转进行飞行时间质谱分析，采用FlexControl 2.0 软件对标准品进行校正后开始检测样品，每个样品经过300 次激光打靶(5 次点靶，每次打靶2×30次)之后生成质谱图谱，获得有不同质核比的蛋白多肽谱图。应用FlexAnalysis 3.0 软件对获得的图谱进行分析。采用ClinProTools 2.1 软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声;分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列;应用遗传算法对各差异蛋白的敏感性及特异性进行初步评价，建立判别模型并验证，找出组间具有显著差异的蛋白多肽峰值。

1.3.3 使用ELISA 方法检测患者血清蛋白标志物的水平:选择血清中表达有差异的蛋白标记物，使用ELISA方法检测两组血清中蛋白标志物的水平。包被完之后进行封闭，加入待检血清，然后加入兔抗人一抗，再加入HRP 标记羊抗兔二抗，进行显色，终止显色之后放入酶标仪进行检测读数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以表示，采用t 检验，计数资料的比较采用χ2检验，多因素分析采用非条件logistic 回归分析，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 液体芯片飞行时间质谱检测结果 多因素非条件logistic 回归分析，EHD2、Pcyox1 及KING1 差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。将其作为诊断模型中的变量，建立直肠癌血清多肽谱诊断模型 p =1 ÷［1 +e－(0.002EHD2+0.006Pcyox1+0.003KING1)］。各多肽单独诊断直肠癌的判断标准:EHD2 ＞100 μg/ml 诊断为直肠癌，≤100 μg/ml时诊断为正常;KING1 ＞161.69 μg/ml 时诊断为直肠癌，≤161.69 μg/ml 时诊断为正常;Pcyox1 ＞99.3 μg/ml 时诊断为直肠癌，≤99.3 μg/ml 时诊断为正常。以病理检查为“金标准”，KING1 诊断直肠癌的灵敏性、准确率和特异性较高，Pcyox1 的检测灵敏性、准确率和特异性最低。血清多肽谱诊断模型诊断直肠癌的灵敏性、准确率及特异性分别为82.3%、87.4%及92.1%，见表2。血清多肽谱诊断模型诊断直肠癌的ROC 曲线面积为0.892%，见图1。

表1 多因素非条件logistic 回归分析结果

表2 EHD2、Pcyox1、KING1 和诊断模型诊断直肠癌的效果

图1 EHD2、Pcyox1、KING1 诊断直肠癌的ROC 曲线

2.2 直肠癌组与对照组血清EHD2、Pcyox1、KING1 的表达水平比较 直肠癌组EHD2、KING1 表达水平明显高于对照组(P ＜0.05)，Pcyox1 表达水平明显低于对照组(P ＜0.05)。见表3。

表3 直肠癌组与对照组血清EHD2、Pcyox1、KING1 表达水平比较(，μg/ml)

表3 直肠癌组与对照组血清EHD2、Pcyox1、KING1 表达水平比较(，μg/ml)

组别 n EHD2 Pcyox1 KING1直肠癌组119 9.87±3.55 2.54±0.87 6.22±2.51对照组 127 4.92±2.14 3.62±1.04 4.38±1.67 t 值 2.583 1.987 2.144 P 值0.014 0.041 0.037

3 讨 论

在西方国家，结直肠癌发病率及致死率在所有癌症中分别居第二位和第三位［6］，近年我国直肠癌发病率呈明显递增趋势［7－8］。结直肠癌患者的存活率往往与其临床诊断时肿瘤的发展程度有明显关系。结直肠癌属于误漏率较高的一类肿瘤，其误漏诊率高达30%，且早期结直肠癌的检出率不超过0.5%［9－11］。这可能与以下几个方面有紧密的联系:(1)结直肠癌的相关知识并未在普通大众中普及，群众就医不及时;(2)医生往往只注重临床表现，对症治疗以缓解患者症状，未深究病因，导致误、漏诊;(3)并发痔疮、消化道出血等的患者更易被误诊漏诊;(4)临床随访无针对性或随访周期不足;(5)诊断方式单一、复杂且昂贵;(6)不重视对结直肠癌的早期普查。

差异蛋白质组学的核心是寻找某种特定因素引起样本之间蛋白质表达谱的差异，揭示并验证表达差异的蛋白质谱在生理或病理过程中的变化。进一步对蛋白质组差异信息分析后，理论上可以推断造成这种变化的原因。现代蛋白质组学技术如双向电泳技术、固体蛋白芯片、傅立叶变换质谱技术、蛋白指纹技术，又称为表面增强激光解析电离飞行时间质谱等［12－14］，给临床肿瘤早期标志物的发现带来了划时代的意义，其将传统的通常每次只能测定一个蛋白标志物革命性地发展为每次可测定数十个，甚至数百个蛋白，同时极大地提高了诊断的灵敏性和特异性。本文结果显示，直肠癌组EHD2、KING1 表达水平明显高于对照组(P ＜0.05)，Pcyox1 表达水平明显低于对照组(P ＜0.05)，提示EHD2、Pcyox1、KING1 蛋白与直肠癌的发生存在一定的关系。我们认为直肠组患者血清KING1 水平升高有可能与肝脏本身的功能变化有关。文献报告KING1 由肝脏分泌，因此其表达升高很可能与肝细胞的合成增加有关［14］。本文多因素非条件logistic 回归筛选出EHD2、Pcyox1及KING1 作为诊断模型中的变量，建立血清多肽谱诊断模型。该血清多肽谱诊断模型诊断直肠癌具有较高的灵敏性、准确率及特异性，分别为82.3%、87.4%及92.1%，且ROC 曲线面积为89.2%。虽然血清多肽谱诊断模型与KING1 单独诊断直肠癌比较，灵敏性、准确率稍低，但特异性好。

综上所述，直肠癌血清多肽谱诊断模型诊断直肠癌的灵敏性、准确率均较高，特异性好，用于临床诊断直肠癌具有一定的价值。

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