结肠癌患者血清miRNA表达谱分析

荣 维，宋丽芳，朱 旭，宋丽萍

（1.抚顺市矿务局总医院消化内科，辽宁 抚顺 113008；2.抚顺市中心医院消化内科，辽宁 抚顺 113008；3.中国科学院微生物研究所病源室，北京 100101）

结肠癌患者血清miRNA表达谱分析

荣 维1，宋丽芳2，朱 旭2，宋丽萍3

（1.抚顺市矿务局总医院消化内科，辽宁 抚顺 113008；2.抚顺市中心医院消化内科，辽宁 抚顺 113008；3.中国科学院微生物研究所病源室，北京 100101）

目的 探讨结肠癌患者血清中miRNA分子的表达差异，寻找潜在的结肠癌诊断分子标记物。方法以12例正常人血清样本为对照组，采用miRNA芯片技术对12例结肠癌患者血清样本的miRNA表达谱进行分析；随后，扩大患者样本量至40例，扩大对照组样本量至45例，采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对差异表达的miRNA分子进行验证分析。结果芯片结果显示，与对照组比较，结肠癌患者血清miRNA表达谱发生了显著的变化，其中3条miRNA表达水平上调，21条miRNA表达水平下调；Real-time PCR验证实验结果表明，与对照组比较，结肠癌患者血清中miR-508和miR-502-5p的表达水平明显下调。结论miR-508和miR-502-5p可作为结肠癌诊断的潜在分子标记物进行开发。

结肠癌；血清；miRNA；芯片；实时荧光定量PCR

结肠癌是最常见的消化系统肿瘤之一。目前结肠癌临床诊断的金标准方法为电子结肠镜诊断技术，该技术需要一定的设备和技术支持，对操作者的操作熟练程度要求较高,诊断时需要侵入人体检查，并且有发生出血及穿孔的并发症危险，因此有必要研发一些新型诊断方法以减轻患者的痛苦和降低诊断的风险[1]。

microRNA(miRNA)是一类不编码蛋白质的RNA分子，长度为18～22 nt，通过靶向结合mRNA分子的3'UTR端来实现对基因表达的调控[2-11]。近年来，很多学者已经证实肿瘤组织中的miRNA分子可作为新型标志物应用于肿瘤临床诊断[12-17]。有研究表明，miRNA可以在血清中稳定存在，因此循环miRNA作为新颖的生物标志物受到了广泛的关注，并且其可作为疾病诊断标志物的潜力已得到认可。

本研究以正常人的血清样本为对照，利用miRNA芯片筛选技术对比分析了结肠癌患者血清中miRNA表达谱变化；随后，扩大结肠癌患者样本量至40例，对照组样本量至45例，应用Real-time PCR技术并对芯片的结果进行验证，最终筛选获得了两个在结肠癌患者血清中特异性低表达的miRNA分子。本研究结果为结肠癌诊断提供了新型潜在分子标记物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1～12月12例结肠癌患者[年龄平均(62.2±8.6)岁，男性、女性各6例]血清作为研究对象(结肠癌组)。所有研究对象均为术后病理诊断为未发生转移的原位结肠癌患者，在采集样本前均未接受过化疗药物治疗以及切除术处理。另收集12例健康人[年龄平均(60.2±6.4)岁，男性、女性各6例]血清作为对照组。本研究获得抚顺市中心医院以及抚顺市矿务局总医院伦理委员会批准，所有组织标本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.2 血浆样本收集 采集受试者静脉血4 ml于EDTA抗凝管中，轻轻颠倒数次后静置10 min，于室温2 500 r/min离心15 min，分两层，吸取上层血浆400µl转移至一个EP(RNase free)管中，-70℃保存。

1.3 血浆总RNA提取 将保存的血浆置于冰上溶解，4℃，12 000 r/min离心5 min，吸取上层血浆300µl转移至一个EP(RNase free)管中，用Ambion mir VanaTMPARISTM提取试剂盒按说明书提取。

1.4 miRNA芯片分析 将患者组和对照组的样本按照1.3中的方法提取RNA分子。将提取获得的RNA分子送到ABI(Applied Biosystems by Life Technologies)公司进行miRNA芯片分析。

1.5 Real-time PCR检测miRNA的表达 分别按照1.3中的方法提取患者组和对照组血浆样本的RNA分子，使用miRcute miRNAcDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)反转录获得cDNA分子，使用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)定量检测样本中miRNA分子的表达，使用U6分子作为检测内参。

1.6 结肠癌血浆中miRNA分子标志物的验证 为了筛选血浆中miRNA分子的标志物，2013年 1～12月我们扩大收集了40例结肠癌患者[年龄平均(61.4±10.27)岁，男22例，女18例]的血清样本，所有研究对象均为术后病理诊断为未发生转移的原位结肠癌患者，结肠癌患者在采集样本前均未接受过化疗药物治疗以及切除术处理。另收集45例健康对照者[年龄平均(62.2±12.01)岁，男24名，女21名]血浆样本作为对照组进行独立样本的验证。本研究获得抚顺市中心医院以及抚顺市矿务局总医院伦理委员会批准，所有组织标本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.7 统计学方法 miRNA芯片实验结果按照Ratio≥1.4或≤0.7倍为标准，筛选出患者组和对照组之间差异；临床特征与分组间的关系用Mann-Whituey U和Student's-t-test分析；以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芯片分析结肠癌患者血清中miRNA表达谱变化 利用miRNA芯片分析结肠癌患者混合血清中miRNA表达谱的变化，以U6表达水平作为检测内参。以Ratio≥1.4或≤0.7倍为标准，筛选出发生变化的miRNA分子。结果如表1所示，其中表达上调的miRNA分子有3个，表达下调的miRNA分子有21个。

表1 结肠癌患者血清中miRNA表达的变化

2.2 Real-time PCR验证芯片检测结果 为了进一步验证芯片结果，筛选出结肠癌血浆中miRNA分子标志物群，我们将结肠癌患者样本量扩大至40例(未转移原位结肠癌，未经过手术和接受过化疗)，对照样本量扩大至45例。利用Real-time PCR技术对所有样本中上述24条miRNA分子进行独立样本检测。结果如图1所示，在结肠癌患者血浆中miR-508 (Mann-WhitneyU=7.28，P=0.028)和 miR-502-5p (Mann-Whitney U=8.65，P=0.035)的表达水平较正常对照组均有显著降低(P＜0.05)。

图1 血浆中miRNA在结肠癌组与正常组的相对表达水平

3 讨论

在本研究中，为了筛选获得的结肠癌患者血浆中miRNA分子标志物群，笔者2013年1～12月共收集了12例结肠癌血浆样本(患者未接受化疗和手术处理)进行miRNA表达谱的分析，以12例正常人血浆作为对照组，并以U6的表达水平作为内参。研究结果表明，结肠癌患者血浆中共有24条miRNA分子的表达水平发生了显著性变化。为了进一步验证miRNA芯片的筛选结果，我们扩大了样本收集量，将结肠癌患者样本扩大至40例，对照组样本扩大至45例。用Real-time PCR技术验证筛选获得的24个miRNA分子在独立样本中的表达情况，结果显示在结肠癌患者血浆中miR-508和miR-502-5p这两条miRNA分子的表达水平较对照组有显著下降(P＜0.05)。

众所周知，结肠癌的早期诊断对于患者的存活率有较大影响[18-20]。因此，本研究会继续扩大收集样本量，深入分析miR-508和miR-502-5p在不同时期，特别是早期的结肠癌患者血清中的表达水平，进一步探讨miR-508和miR-502-5p作为潜在结肠癌诊断分子标记物的可能性。

[1]Onouchi S,Matsushita H,Moriya Y,et al.New method for colorectal cancer diagnosis based on SSCP analysis of DNA from exfoliated colonocytes in naturally evacuated feces[J].Anticancer Res, 2008,28(1A):145-150.

[2]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[3]Liu J,Carmell MA,Rivas FV,et al.A role for the P-body component GW182 in microRNA function[J].Nat Cell Biol,2005,7(12): 1261-1266.

[4]Tomari Y,Zamore PD.Perspective:machines for RNAi[J].Genes Dev,2005,19(5):517-529.

[5]Hwang HW,Mendell JT.MicroRNAs in cell proliferation,cell death, and tumorigenesis[J].Br J Cancer,2006,94(6):776-780.

[6]Bhattacharyya SN,Habermacher R,Martine U,et al.Relief of microRNA-mediated translational repression in human cells subjected to stress[J].Cell,2006,125(6):1111-1124.

[7]Doench JG,Petersen CP,Sharp PA.siRNAs can function as miRNAs[J].Genes Dev,2003,17(4):438-442.

[8]Hutvagner G,Zamore PD.A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex[J].Science,2002,297(5589):2056-2060.

[9]Zeng Y,Cullen BR.Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells[J].RNA,2003,9(1):112-123.

[10]Scaria V,Hariharan M,Maiti S,et al.Host-virus interaction:a new role for microRNAs[J].Retrovirology,2006,3:68.

[11]Wienholds E,Plasterk RH.MicroRNA function in animal development[J].FEBS Lett,2005,579(26):5911-5922.

[12]Habbe N,Koorstra J,Mendell J,et al.MicroRNA miR-155 is a biomarker of early pancreatic neoplasia[J].Cancer Biol Ther,2009,8 (4):340-346.

[13]Yang N,Kaur S,Volinia S,et al.MicroRNA microarray identifies Let-7i as a novel biomarker and therapeutic target in human epithelial ovarian cancer[J].Cancer Res,2008,68(24):10307-10314.

[14]Mattie MD,Benz CC,Bowers J,et al.Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies[J].Mol Cancer, 2006,5:24.

[15]Liu T,Tang H,Lang Y,et al.MicroRNA-27a functions as an oncogene in gastric adenocarcinoma by targeting prohibitin[J].Cancer Lett,2009,273(2):233-242.

[16]Guo J,Miao Y,Xiao B,et al.Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(4):652-657.

[17]Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer:a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol,2010,11(2): 136-146.

[18]Domingo E,Belmonte I,Nieto L,et al.Evaluation of PIK3CA mutation as a predictor of benefit from nonsteroidal anti-inflammatory drug therapy in colorectal cancer[J].J Clin Oncol,2013,31(34): 4297-4305.

[19]Greenberg E,Besser MJ,Ben-Ami E,et al.A comparative analysis of total serum miRNA profiles identifies novel signature that is highly indicative of metastatic melanoma:a pilot study[J].Biomarkers,2013,18(6):502-508.

[20]Juneja M,Ilm K,Schlag PM,et al.Promoter identification and transcriptional regulation of the metastasis gene MACC1 in colorectal cancer[J].Mol Oncol,2013,7(5):929-943.

Analysis of miRNA profile in serum of patients with colon cancer.

RONG Wei1,SONG Li-fang2,ZHU Xu2,SONG Li-ping3.
1.Department of Gastroenterology,Fushun Mining Bureau General Hospital,Fushun 113008,Liaoning, CHINA;2.Department of Gastroenterology,the Central Hospital of Fushun,Fushun 113008,Liaoning,CHINA;3. Department of Pathogen,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing 100101,CHINA

ObjectiveTo profile the miRNA expression pattern in the serum of patients with colon cancer, and to explore the potential molecular marker for the diagnosis of colon cancer.MethodsThe 12 serum samples of colon cancer patients were collected and miRNA chips were used to analyze the miRNA profile of colon cancer(the study group).The 12 serum samples of normal persons were collected as control(the control group).And then the samples of colon cancer and control were extended to 40 cases and 45 cases respectively.Real-time PCR was used to further validate the expression level of miRNA in samples of colon cancer.ResultsCompared to the control group,the miRNA profile of the study group represented obvious changes,with 3 miRNAs up-regulated and 21 miRNAs down-regulated.The results of real-time PCR showed that the expression levels of miR-508 and miR-502-5p were down-regulated significantly in the study group compared to the control group.ConclusionmiR-508 and miR-502-5p can be explored as potential diagnosis marker for colon cancer.

Colon cancer;Serum;miRNA;Chip;Real-time PCR

R735.3+5

A

1003—6350（2015）06—0841—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0300

2014-09-18)

宋丽芳。E-mail：slp_0705@sina.com