皮质酮浓度对SD大鼠成骨细胞成骨基因表达的影响

康银辉，魏 波，祝兆波，郭伟雄，王朝军，宋丽君，林 颢，李广盛，楚佳奇，曾 荣

(广东医学院附属医院骨科中心1、生殖中心2，广东 湛江 524001)

皮质酮浓度对SD大鼠成骨细胞成骨基因表达的影响

康银辉1，魏 波1，祝兆波1，郭伟雄1，王朝军1，宋丽君2，林 颢1，李广盛1，楚佳奇1，曾 荣1

(广东医学院附属医院骨科中心1、生殖中心2，广东 湛江 524001)

目的 探讨皮质酮对离体SD大鼠成骨细胞功能的影响。方法采用多次胶原酶组织消化法获得新生SD大鼠颅骨中的成骨细胞作为研究对象，用倒置显微镜及碱性磷酸酶、钙结节染色观察成骨细胞形态，CCK-8法检测皮质酮对成骨细胞增殖的影响，根据CCK-8结果将SD大鼠成骨细胞分成四组，分别用含不同浓度的皮质酮(0µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L)的DMEM(H)培养基培养，作用24 h后，测定成骨细胞内碱性磷酸酶含量，采用RT-PCR检测成骨细胞内COL1A、OCN、ALP基因表达，采用Western blot检测成骨细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达。结果CCK-8结果显示皮质酮能抑制成骨细胞的增殖，皮质酮能抑制成骨细胞内碱性磷酸酶的生成，与浓度明显相关；RT-PCR与Western blot检测可见COL1A、OCN、ALP基因表达及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达下降。结论皮质酮在超生理剂量的浓度下能抑制成骨细胞增殖及细胞内碱性磷酸酶的合成，减少COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达。

皮质酮；成骨细胞；基因表达；成骨

糖皮质激素(Glucocorticoids，GCs)被广泛用来治疗过敏性、自身免疫性和炎症性疾病，但是，长期、高剂量应用会引起严重的并发症，如骨坏死[1]和骨质疏松症[2]。由于糖皮质激素良好的临床疗效，很多患者必须长期使用，因此研究糖皮质激素对成骨细胞的影响有重要意义。本文采用体外培养的大鼠颅骨成骨细胞，给予不同浓度的皮质酮，观察其对成骨细胞增殖、细胞内碱性磷酸酶、成骨功能蛋白及相关基因表达的变化，阐述糖皮质激素对成骨细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 实验动物：清洁级新生24 h内的SD乳鼠10只，购于广西医科大学动物实验中心。主要试剂：皮质酮(日本梯希爱)，茜素红S (上海华东试剂公司)，PCR引物(上海生物工程)，蛋白抗体(SANTA CRUZ公司)，CCK-8试剂盒(同仁化学研究所)，碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(南京建成)。

1.2 成骨细胞的提取 新生24 h内SD大鼠胎鼠提取成骨细胞；无菌取下胎鼠颅骨放入无菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物质，然后用剪刀将颅骨头剪成(1×1)mm3大小的组织块，移至15 ml离心管中，加入5 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型胶原酶的消化液消化，消化6个循环，每次在37℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的细胞悬液，1 300 r离心10 min，弃上清，沉淀的细胞用不含血清的高糖DMEM洗剂离心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬吹打均匀后，以1×105/ml接种于培养瓶中，放入5%CO2、37℃的培养箱中培养，24 h后换液，以后每2～3 d换液并在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至半汇合铺满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。

1.3 成骨细胞的鉴定 成骨细胞形态观察:每日倒置显微镜下观察细胞生长。将传到第三代的细胞以2×105个/ml接种到铺有盖玻片的六孔板中进行细胞爬片，3～4 d后将盖玻片捞出进行细胞内碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下观察。茜素红染色：称取0.1 g茜素红粉剂溶于100 ml蒸馏水中配成0.1%的茜素红溶液，将爬片10～14 d后的盖玻片捞出，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗两遍，用0.1%的茜素红溶液染色30 min后蒸馏水冲洗两遍，封片，倒置显微镜下观察。

1.4 成骨细胞增殖能力分析 将传到第三代的细胞以5×104/ml密度接种于96孔板，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养6 h，使细胞完全贴壁。以0µmol/L、0.01µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L、100µmol/L的皮质酮作用24 h后，以CCK-8法测定细胞存活率。

1.5 细胞内碱性磷酸酶含量测定 根据CCK-8的结果将实验分成四组，分别设0µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L四个不同的浓度。将传到第三代的细胞以5×104/ml密度接种于6 cm培养皿中，待细胞完全贴壁后，弃培养基，再加入皮质酮作用浓度分别为0µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L培养液，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，提取各组细胞总蛋白，蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度，再根据碱性磷酸酶(AKP)试剂盒说明测定细胞内碱性磷酸酶含量。

1.6 细胞内COL1A、OCN、ALP基因表达量检测 以105个/孔的密度将细胞接于6孔板中,加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，再加入皮质酮作用浓度分别为0µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L培养液，培养24 h、48 h、72 h后提取总RNA，经过浓度测定、逆转录反应后行实时荧光定量PCR反应。COL1A、OCN、ALP和内参β-actin引物序见图1。反应条件为首先95℃变性30 s；然后按95℃5 s，60℃20 s扩增40个循环。每个组的标本重复三次。在反应的第二阶段，在每个循环结束后采集荧光信号强度，60℃～95℃间进行融解曲线分析，以分析反应中引物的特异性。测得的Ct值来计算每个样本目的基因的相对表达量。

图1 PCR引物序列(F：正向引物，R：反向引物)

1.7 细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表达检测 采用Westernblot法。提取各组细胞总蛋白，蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度，与5×上样缓冲液混合，100℃变性5 min。各种一抗以1:1 000稀释，内参(GAPDH)按1:2 000稀释，二抗按1:5 000稀释。

2 结果

2.1 成骨细胞的分离与鉴定 成骨细胞倒置显微镜观察：原代细胞培养1 d后贴壁，细胞呈梭形、多角形，7～10 d单层铺满瓶壁。传代细胞多为梭形(图2)。碱性磷酸酶(ALP)染色：取第三代细胞做碱性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黄色为阳性(图3)。茜素红(钙化结节染色)染色：细胞汇合时均呈多层重叠生长，细胞局部堆集成灶状，形成钙结节，染色后钙结节呈橘红色(图4)。

2.2 不同浓度皮质酮对成骨细胞增殖的影响 CCK-8示：高浓度皮质酮对细胞增殖有抑制作用，随着浓度增加，对细胞增殖抑制明显增加，地塞米松浓度在0.01～100 μmol/L均可抑制细胞增殖，并呈浓度依赖性(与对照组比较，P＜0.05)，见图5。

2.3 皮质酮作用后成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量测定 成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量测定显示在皮质酮浓度为0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L时，与对照比较，ALP含量呈下降趋势，呈浓度依赖性(与对照组比较，P＜0.05)，见图6。

2.4 应用皮质酮后荧光定量PCR测定成骨细胞内COL1A、OCN、ALP基因表达 从测定的结果可以看出当不同的浓度的皮质酮分别作用成骨细胞24 h后，细胞内COL1A、OCN、ALP表达总体呈下降趋势，其中COL1A、ALP基因表达在皮质酮浓度为10.0µmol/L，比皮质酮浓度为0.1µmol/L、1.0µmol/L稍有升高(与对照组比较，P＜0.05)，见图7。

图2 原代细胞铺满成骨细胞(40×)

图3 碱性磷酸酶染色(100×)

图4 茜素红S染色(40×)

图5 皮质酮作用成骨细胞24 h后细胞存活率(与对照组比较，aP＜0.05)

图6 皮质酮作用成骨细胞24 h后细胞内碱性磷酸酶含量(与对照组比较，aP＜0.05)。

图7 不同浓度的皮质酮对成骨细胞作用24 h后对细胞内COL1A、OCN、ALP基因表达的影响(与对照组比较，aP＜0.05)

2.5 蛋白免疫印迹检测成骨细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达量 皮质酮0µmol/L、0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L分别作用成骨细胞24 h后，与对照组比较，成骨细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表达量均呈下降趋势，其中COL1A在皮质酮浓度为10.0µmol/L时与对照组比较有明显差异，OCN、RUNX-2在皮质酮浓度为1.0µmol/L、10.0µmol/L出现明显差异，三种基因的表达的下降均与皮质酮浓度相关(与对照组比较，P＜0.05)，见图8。

图8 蛋白免疫印迹检测成骨细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达量(与对照组比较，aP＜0.05)

3 讨 论

目前糖皮质激素在临床应用越来越广泛，相应的其应用并发症也越来越多，目前，糖皮质激素对机体骨骼系统影响的机制仍不明确，存在高凝低纤溶微血管血栓栓塞学说、脂肪代谢紊乱学说、骨内高压学说、二次碰撞学说、遗传以及基因多态性学说等[3-5]。

Ogoshi等[6]发现地塞米松能诱导成骨细胞的凋亡，这种作用与地塞米松的浓度密切相关。Xu等[7]发现地塞米松作用小鼠4周后，其成骨细胞凋亡增加3倍，28%的皮质骨干骺端骨细胞凋亡。已经有大量研究表明，超生理剂量的糖皮质激素能抑制成骨细胞的骨生成活性，促进破骨细胞的骨吸收活性，最终导致骨量不可逆丢失，形成骨质疏松症[8-10]。

近来有关的研究表明，糖皮质激素可以通过脂肪细胞来间接的影响成骨细胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓内骨髓间充值干细胞转录因子Cbfa1/ Runx2表达，促使特异性转录因子PPARγ的表达，从而促使骨髓间从质干细胞向脂肪细胞分化，抑制其向成骨细胞的分化，导致脂肪细胞数量/成骨细胞数量比例增加[11-12]。

本实验以SD大鼠原代成骨细胞为研究对象，CCK-8细胞增殖实验表明，不同浓度皮质酮对成骨细胞的增殖均有抑制作用，并呈浓度依赖性。文献报告生理剂量的激素(≤10-8mol/L)可以促进成骨细胞的分化，然而超生理剂量的激素降低成骨细胞的活性，抑制成骨细胞的分化[13-15]。因此结合CCK-8试验本文采用的0.1µmol/L、1.0µmol/L、10.0µmol/L为超生理剂量用于实验。

ALP能使局部钙、磷浓度升高，有助于矿物质化的正常进行，是促进骨间质矿化的重要酶，目前认为ALP活性的高低是反应成骨成熟、功能状态的一个重要指标，成骨细胞内的COL1A、OCN、RUNX-2均是成骨细胞成骨功能的重要指标。本实验发现不同浓度皮质酮作用成骨细胞后，细胞内碱性磷酸酶含量、基因、蛋白表达均呈下降趋势；荧光定量PCR结果显示不同浓度皮质酮作用成骨细胞后，细胞内的COL1A、OCN基因表达都呈下降趋势，蛋白免疫印迹检测显示成骨细胞内COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表达下降，并与皮质酮剂量明显相关。因此，皮质酮能抑制成骨细胞内碱性磷酸酶量、COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表达。

本文结果提示皮质酮在超生理剂量浓度时能抑制上述指标，对成骨细胞成骨活性起着抑制效应。本实验的不足之处在于仅做了细胞实验，还需进一步体内实验验证。

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Effect of corticosterone concentration on osteoblastic gene expression of SD rat osteoblasts.

KANG Yin-hui1,WEI Bo1,ZHU Zhao-bo1,GUO Wei-xiong1,WANG Chao-jun1,SONG Li-jun2,LIN Hao1,LI Guang-sheng1,CHU Jia-qi1, ZENG Rong1.Orthopedic Centre1,Lab of Reproductive Medicine2,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different corticosterone concentration on the gene expression of SD rat osteoblastsin vitro.MethodsNewborn SD rat osteoblasts in the skull were obtained by many times of collagenase digestion as the object of study.The osteoblastic morphology was observed using inverted microscope,alkaline phosphatase and calcium nodes dyeing.And the effect of corticosterone concentration on osteoblastic proliferation was detected by CCK-8.According to the scores of CCK-8,the SD rat osteoblasts were divided into four groups with different corticosterone concentrations of DMEM(H)culture(0 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10.0 μmol/L). After 24 hours of DMEM(H)culture,content of osteoblastic alkaline phosphatase were measured,gene expressions of osteoblastic COL1A,OCN,ALP were detected by RT-PCR,and the protein expression of osteoblastic COL1A, OCN,RUNX-2 were measured by western blot.ResultsThe scores of CCK-8 showed that corticosterone can restrain the proliferation of SD rat osteoblasts and the formation of osteoblastic alkaline phosphatase,which were significantly related to concentration.And the results of RT-PCR and western blot both showed decreased expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.ConclusionCorticosterone beyond physical dosage can inhibit the proliferation of osteoblasts and synthesis of intracellular alkaline phosphatase,and reduce the expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.

Corticosterone;Osteoblasts;Gene expression;Osteogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2661—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0969

2015-05-12)

广东省科技计划项目（编号：2011B031800172）

魏 波。E-mail：webjxmc@163.com