检验性失血对MODS大鼠血清促红细胞生成素、血红蛋白和器官功能的影响

周忠义，谢晓红，田 佳，魏晓芬

(海南省人民医院重症医学科，海南 海口 570311)

检验性失血对MODS大鼠血清促红细胞生成素、血红蛋白和器官功能的影响

周忠义，谢晓红，田 佳，魏晓芬

(海南省人民医院重症医学科，海南 海口 570311)

目的 探讨不同检验性失血量对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠血红蛋白(Hb)、促红细胞生成素(EPO)、器官功能及肾脏炎症介质、氧化应激、细胞凋亡的影响。方法120只SD大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)术后按照随机数表法均分为四组：MODS组(M组)、MODS+检验性失血组1(ML1组)、MODS+检验性失血组2 (ML2组)、MODS+检验性失血组3(ML3组)，每组各30只。ML1组手术关腹后立即尾静脉切开放血1 ml后压迫止血，ML2组手术关腹后立即及术后24 h尾静脉切开各放血1 ml后压迫止血，ML3组手术关腹后立即、术后24 h及48 h尾静脉切开各放血1 ml后压迫止血。72 h统计各组病死率，每组取10只心脏取血2 ml，检测Hb、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、EPO、肿瘤坏死因子(TNF-α)，取肾脏组织检测核转录因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记(TUNEL)阳性细胞数。结果制模72 h，M组死亡10只，病死率为33.3%，ML1组死亡13只，病死率为40%，ML2组死亡15只，病死率为50%，ML3组死亡18只，病死率为60%，两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。与M组比较，ML1、ML2、ML3组大鼠72 h Hb明显下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr、TNF-α、肾脏NF-κB、MDA和TUNEL阳性细胞数明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。ML1组肾脏EPO浓度比M组略有升高，但差异无统计学意义(P> 0.05)，ML2、ML3组肾脏EPO浓度比M组明显增高(P＜0.05)。结论检验性失血可能通过贫血、上调EP0水平、炎症反应、氧化应激和促进细胞凋亡导致MODS大鼠器官功能障碍加重并影响预后。

盲肠结扎穿孔术；多器官功能障碍综合征；检验性失血；促红细胞生成素；细胞凋亡

尽管医学不断进步，但是脓毒症(Sepsis)及其相关的多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)仍然是急危重症患者的主要死亡原因。MODS患者因为内环境紊乱、病情复杂多变，需要频繁抽血化验，由此引起的检验性失血性贫血及其对病情的影响未引起临床足够的重视。姜东辉等[1]观察到ICU患者抽血化验用血量很大，每例患者总检验性失血量中位数为134.50 ml(32.5～751.5 ml)，患者的检验性失血与患者治疗过程中器官功能障碍数目、Marshall评分、ICU住院日相关，我们认为检验性失血已成ICU中的一个潜在危机。本实验模拟临床检验失血观察不同检验性失血量对盲肠结扎穿孔MODS大鼠血红蛋白、促红细胞生成素、器官功能、肾脏炎症介质、氧化应激及细胞凋亡的影响，为临床防治多器官功能障碍综合征提供实验和理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物分组 健康清洁级Sprague Dawley雄性大鼠120只、体重250～280 g，由海南医学院动物实验室提供。所有动物均自由觅食和觅水。按随机数表法分为4组：MODS组(M组)、MODS+检验性失血组1(ML1组)、MODS+检验性失血组2(ML2组)、MODS+检验性失血组3(ML3组)，每组各30只。

1.2 实验方法 所有动物实验前夜禁食，自由饮水。10%水合氯醛(0.3 g/kg体重)腹腔注射麻醉，腹部正中线切开腹壁进入腹腔，行盲肠远端起至回盲瓣50%处结扎，用9#针头在盲肠结扎的中间位置全层穿透，并轻挤出少许粪便以保证穿孔处的开放性。盲肠放回腹腔，连续缝合关腹。各组均于术毕皮下注射生理盐水30 ml/kg，以补充术中液体的丢失。所有动物手术在10 min之内完成，保持一致性，术后分笼饲养。ML1手术关腹后立即尾静脉切开放血1 ml后压迫止血；ML2手术关腹后立即及术后24 h尾静脉切开各放血1 ml后压迫止血；ML3手术关腹后立即、术后24 h及48 h尾静脉切开各放血1 ml后压迫止血。于72 h每组取10只经心脏取血2 ml并迅速放血处死，检测大鼠血液中血红蛋白(Hb)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、促红细胞生成素(EPO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)，取肾脏组织用10%甲醛固定，做组织病理切片，部分用于检测核转录因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记(TUNEL)阳性细胞数计数。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及72 h病死率比较 四组大鼠12 h后出现病态，蜷缩，竖毛，呼吸急促，鼻腔溢出分泌物，眼角出现渗出物，活动、觅食、饮水减少，陆续有大鼠死亡。随时间推移检验性失血组(ML1、ML2、ML3)大鼠精神萎靡，倦卧少动嗜睡，皮毛膨松枯槁，呈浅黄色，鼻唇淡白失泽，耳尾苍白发凉，团缩拱背，病死数目增加，以ML3组最明显，而M组大鼠48 h后一般情况有所好转。制模72 h，M组死亡10只，病死率为33.3%；ML1组死亡13只，病死率为40%；ML2组死亡15只，病死率为50%；ML3组死亡18只，病死率为60%，两两比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 检验性失血72 h对MODS大鼠Hb、CK-M0B、ALT、BUN、Cr的影响 检验性失血组大鼠Hb明显下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr比M组明显增高，两两比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.3 检验性失血72 h对MODS大鼠血清TNF-α、EPO、肾脏NF-κB、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响 检验性失血组大鼠血清中TNF-α、EPO及肾脏NF-κB、MDA、TUNEL数目逐渐增高，两两比较除了ML1与M组血清EPO差异无统计学意义(P>0.05)外，余差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 检验性失血72 h对MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影响(±s)

表1 检验性失血72 h对MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影响(±s)

注：与M组比较，aP＜0.05；与ML1组比较，bP＜0.05；与ML2组比较cP＜0.05。

组别Hb(g/L)CK-MB(pg/ml)ALT(U/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L) M组(n=10) ML1组(n=10) ML2组(n=10) ML3组(n=10) 106.7±7.7 91.1±6.4a82.7±3.6ab70.9±1.9abc35.70±4.85 67.16±6.41a95.73±4.85ab108.17±5.37abc443.42±5.35 72.69±6.57a103.44±5.35ab143.29±6.98abc7.6±3.6 10.4±2.4a15.6±4.6ab25.5±6.2abc69.7±5.4 85.1±6.7a129.7±9.4ab188.2±11.8abc

表2 检验性失血72 h对MODS大鼠血清TNF-α、EPO、肾脏NF-κB、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响(±s)

表2 检验性失血72 h对MODS大鼠血清TNF-α、EPO、肾脏NF-κB、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响(±s)

注：与M组比较，aP＜0.05；与ML1组比较，bP＜0.05；与ML2组比较，cP＜0.05。

组别TNF-α(pg/ml)EPO(ng/ml)NF-κB(IOD)MDA(nmol/mg)TUNEL M组(n=10) ML1组(n=10) ML2组(n=10) ML3组(n=10) 56.503±4.30 67.141±6.52a86.503±4.38ab98.033±7.79abc1.86±0.49 1.91±0.51 2.34±0.62ab2.95±0.78abc8857.026±1217.827 9253.572±3114.180a11026.639±3256.705ab16256±5802.634abc8.56±0.46 9.82±0.82a11.79±1.05ab15.03±1.92abc4.67±2.03 9.46±1.52a14.37±2.68ab24.03±3.25abc

3 讨 论

脓毒症及其相关的多器官功能障碍综合征(MODS)是ICU患者常见的合并症，目前仍然缺乏有效的防治方法，是住院急危重症患者的主要死亡原因，病死率高达50%～100%，严重威胁人类健康[2]。

MODS患者因为病情复杂多变、内环境紊乱，需要频繁地抽血化验以指导诊断和治疗，由此导致的检验性贫血和器官功能损害却未引起临床医师足够的重视。Shaffer[3]观察了43例机械通气时间>24 h的ICU患者结果发现患者住院期间平均被采血(69±59)次，采血总量为(57±1120)ml，人均采血量为(245±213)ml，日均采血量为(16±7)ml，统计学分析得出患者检验性失血与病情严重程度、每天采血次数、采血量相关。进一步研究证明当人体每日失血量> 50 ml时就可能出现贫血，而且检验性失血不仅与贫血和输血率的增加有关，还可能加重组织器官缺氧，使MODS患者雪上加霜，增加患者病死率和医疗费用[4]。本次动物试验模拟临床检验失血观察从少到多检验性失血量对MODS大鼠72 h的影响发现Hb显著下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr显著增高，病死率增加，证明检验性失血可导致贫血并加重多器官功能障碍和影响预后，失血量越大越明显。

脓毒症所致MODS是机体炎症反应失控的结果，其核心是全身炎症反应与代偿性抗炎反应失衡[5]。TNF-α是细胞因子网络相互调控的核心部分，可促进其他细胞因子和炎症介质的释放，产生炎症的瀑布效应，启动后续的一系列病理生理改变[6]。本研究结果发现，单纯盲肠结扎穿孔术制模脓毒症相关性MODS大鼠72 h血清TNF-α含量较低[(56.503±4.30)pg/ml]，从少到多检验性失血盲肠结扎穿孔术MODS大鼠血清中TNF-α显著增高，表明MODS大鼠炎症反应加重与检验性失血量相关，失血量越大炎症反应越明显。

临床上脓毒症相关性MODS合并肾脏损害常见，而且治疗难度明显增加。核转录因子(NF-κB)是细胞内重要的核转录因子，启动和调控一系列炎性因子的基因表达，介导肾脏等脏器损伤[7]。采用免疫组化法检测大鼠肾组织NF-κB表达，衡量大鼠肾脏炎症反应水平；采用硫代巴比妥酸反应方法测定大鼠肾脏丙二醛(MDA)含量，评价脂质过氧化水平；采用TUNEL染色方法测定大鼠肾脏细胞凋亡数目。目前认为脓毒症肾损伤发病机制与血流动力学的变化、内毒素与炎性介质、细胞凋亡等因素有关[8]。本研究发现脓毒症相关性MODS大鼠检验性失血量从少到多72 h肾脏NF-κB、MDA、TUNEL阳性细胞数明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；提示检验性失血通过炎症反应、氧化应激和促进细胞凋亡加重肾损伤。

EPO的作用是维持红细胞造血前体细胞的存活并促进其分裂，诱导晚期红系祖细胞生长成为成熟的红细胞[9]。本次研究结果显示，单次检验性失血MODS组大鼠72 h肾脏EPO浓度与对照组比较升高不明显(P>0.05)，两次以上检验性失血MODS组大鼠72 h肾脏EPO浓度明显增高(P＜0.05)，表明检验性失血诱导MODS大鼠肾脏损伤时存在EPO高表达，提示多次检验性失血可能是EPO生成的主要刺激因素。

综上所述，检验性失血可能通过贫血、上调EPO水平、炎症反应、氧化应激和促进细胞凋亡导致脓毒症相关性MODS大鼠器官功能障碍加重和影响预后。

[1]姜东辉,万献尧.实验室检验失血与医源性贫血——ICU的潜在危机[J].医学与哲学(临床决策论坛版),2007,28(6):50-52.

[2]Shiramizo S,Marra AR,Durao MS,et al.Decreasing mortality in severe sepsis and septic shock patients by implementing a sepsis bundle in a hospital setting[J].PLOS One,2011,6(11):26790.

[3]Shaffer C.Diagnostic blood loss in mechanically ventilated patients [J].Heart Lung,2007,36(3):217-222.

[4]Thomas J,Jensen L,Nahirniak S,et al.Anemia and blood transfusion practices in the critically ill:A prospective cohort review[J]. Heart Lung,2010,39(3):217-225.

[5]Schmidt C,Steinke T,Moritz S,et a1.Acute renal failure andsepsis: Just an organ dysfunction due to septic multiorgan failure[J].Anaesthesist,2010,59(8):682-699.

[6]Granfeidt A,Ebdrup L,Tnnesen E,et a1.Renal cytokine profile in all endotoxemic porcine model[J].Acta Anaesthesiol Scand, 2008,52(5):614-620.

[7]Monick MM,Hunninghake GW.Activation of second messenger pathways in alveolar macrophages by endotoxin[J].Eur Respir, 2002,20:210-222.

[8] Azevedo LC.Mitochondrialdysfunction during sepsis[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2010,10(3):214-223.

[9]Philip RM,Lee AM.Pharm acological targets in the renal peritubular microenVironment:Implications for therapy for sepsis induced acute kidney injury[J].Pharmacology&Therapeutics,2012,134(2): 139-155.

Impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin,erythropoietin and organ function of rats with septic multiple organ dysfunction syndrome.

ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong,TIAN Jia, WEI Xiao-fen.Intensive Care Unit,People`s Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin(Hb),erythropoietin(EPO),organ function,renal inflammatory medium,oxidative stress and cell apoptosis of the rats with septic multiple organ dysfunction syndrome(MODS).MethodsOne hundred and twenty SD rats were averaged into four groups through the random number table after CLP:MODS group(M),MODS+laboratory-testing blood loss group 1(ML1),MODS+laboratory-testing blood loss group 2(ML2),MODS+laboratory-testing blood loss group 3(ML3),with 30 rats in each group.When the surgery was finished and the abdomen was closed,1 ml of blood was drawn immediately after the tail vein phlebotomy in group ML1,then compression was performed to stop bleeding.In group ML2,1 ml of tail vein blood was taken respectively immediately after the surgery and 24 h after surgery,while in group ML3,blood samples was collected 24 h after surgery and 48 h after surgery.Fatality rate was calculated 72 h after the surgery.Ten rats in each group was selected and 2 ml of blood was taken from the heart for detecting Hb,creatine kinase MB(CK-MB),alanine aminotransferase(ALT),urea nitrogen(BUN),creatinine (Cr),EPO,tumor necrosis factorα(TNF-α).Malondialdehyde(MDA),nuclear factor-κB(NF-κB)in the kidney tissue,as well as the amount of TUNEL positive cells were also detected.ResultsAfter 72 h of moulding,10 rats died in the group M and the fatality rate was 33.3%,with 13(40%)died in group ML1,15(50%)died in group ML2 and 18 (60%)died in group ML3.The differences between each two groups were statistically significant(P＜0.05).Compared with group M,the Hb of group ML1,ML2 and ML3 all declined significantly,while the levels of CK-MB,ALT,BUN, Cr,TNF-α,MDA,NF-κB,and the amount of TUNEL positive cells all increased significantly(P＜0.05).EPO concentration in group ML1 was slightly higher than that in group M,but with no statistical difference(P>0.05).The EPO concentration in the group ML2 and ML3 was significantly higher than that in group M(P＜0.05).ConclusionLaborato-ry-testing blood loss could aggravate the organ function disorder and affect the prognosis of rats with septic MODS by anemia,EPO level up-regulation,inflammatory reaction,oxidative stress and cell apoptosis promotion.

Cecal ligation and puncture;Multiple organ dysfunction syndrome;Laboratory-testing blood loss;Erythropoietin(EPO);Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2665—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0970

2015-04-14)

海南省卫生厅科研立项课题(编号：琼卫2012PT-02)

周忠义。E-mail：adslzhouzy@sina.com