右美托咪啶预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及钙循环调控蛋白的影响

李 霞，彭碧文，董 航

(1.武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430000；2.江汉大学附属医院麻醉科，湖北 武汉 430000)

右美托咪啶预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及钙循环调控蛋白的影响

李 霞1，2，彭碧文1，董 航2

(1.武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430000；2.江汉大学附属医院麻醉科，湖北 武汉 430000)

目的 观察右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及心肌细胞钙循环调控蛋白兰尼碱受体(RyR2)和肌浆网钙泵(SERCA2a)的影响。方法45只大鼠随机分为3组，假手术组(Sham组)，缺血再灌注组(I/R组)，右美托咪定预处理组(DEXM组)。DEXM组在缺血前2 h经腹腔注射右美托咪定100 μg/kg。监测各组大鼠缺血30 min及再灌注120 min的血流动力学参数评估心功能，以伊文氏蓝-红四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死面积，以实时定量PCR法检测心肌组织RyR2和SERCA2a的mRNA表达水平。结果I/R组心肌梗死面积(41.5±2.9)%，DEXM组心肌梗死面积(30.8±3.1)%，DEXM组梗死面积明显低于I/R组(P＜0.05)。与Sham组及缺血前比较，I/R组和DEXM组缺血30 min及再灌注120 min时，HR、LVDP、±dP/dt均显著降低(P＜0.05)，LVEDP显著升高(P＜0.05)。I/R组和DEXM组相比，DEXM相LVDP、±dP/dt均高于I/R组(P＜0.05)，LVEDP低于I/R组(P＜0.05)。I/R组和DEXM组心肌组织中RyR2和SERCA2a的mRNA水平均较Sham组降低(P＜0.05)，但DEXM组RyR2和SERCA2a的mRNA水平高于I/R组。结论缺血再灌注前给予右美托咪定预处理可减小心肌梗死面积，促进心肌细胞钙循环，改善心功能，发挥心肌保护作用。

右美托咪定；预处理；缺血再灌注损伤

心肌缺血再灌注损伤是指心肌组织在短期缺血恢复血供后，出现较再灌注前更为严重的心肌结构与功能的损伤。心肌缺血再灌注损伤是临床麻醉工作中常见病理过程，也是围术期意外发生的主要原因之一。右美托咪定(Dexmedetomidine)是一种广泛应用于临床的新型高选择性肾上腺素α2受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗焦虑等效应。研究显示右美托咪定对心血管有多方面的保护作用，本研究拟观察右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及对肌浆网钙循环的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性成年SD大鼠45只(购于武汉大学动物实验中心)，体重200～250 g，随机分为假手术对照组(Sham组)、缺血再灌组(I/R组)、右美托咪定预处理组(DEXM组)，每组各15只。

1.2 缺血再灌注损伤模型 大鼠禁食12 h后，以3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，行气管插管后接小动物呼吸机，调节潮气量3.0 ml/kg，呼吸比2:1，频率60～70次/min。以针形电极刺入大鼠四肢皮下，连接多道电生理记录仪电极行心电监护。于左侧第四肋间开胸，剪开心包暴露心脏。左心耳下方2 mm处结扎冠状动脉前降支，缺血30 min后松开结扎线再灌注120 min。DEXM组在缺血前2 h经腹腔注射右美托咪定100 μg/kg(4 μg/ml)。I/R组则于缺血前2 h腹腔注射等体积生理盐水，Sham组只穿心功能检测。

1.3 血流动力学监测评估心功能 暴露右颈总动脉，将心导管经颈总动脉插入左心室，外端接压力换能器连接于多道生理记录仪上，记录血流动力学变化波型存储于电脑以备后续分析。以心率(HR)、左室舒张压(LVDP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室舒张室内压最大上升/下降速率(±dP/dt)评价心功能。

1.4 心肌梗死面积测定 每组各取5只动物采用伊文氏蓝-红四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死面积。向左室注入4 ml 2%伊文氏蓝后取心脏切除心房及右室，沿室间沟将左室切为1～2 mm的薄片5～6片，置于1%TTC溶液15 min。心肌薄片染成深红色部分是正常组织，染成白色部分为坏死组织。拍照后经图像分析软件计算梗死面积，即梗死区面积/左心室组织切片总面积×100%。

1.5 肌浆网钙泵和兰尼碱受体mRNA检测 用实时定量PCR法检测心肌组织兰尼碱受体(RyR2)和肌浆网钙泵(SERCA2a)的mRNA水平。PCR引物设计用 Premier5.0软件，RyR2引物(F：5'-CCAGTGGGACAGACTGGTGA，R：5'-GCCTTATCCATGCCCA GTAA)，SERCA2a引物(F：5'-TCTGACTTTCGTTGGCTGTC，R：5'-GCCTTTGTTATCCCCAGTG)，内参GAPDH (F：5'-CAACGACCCCTTCATTGACC，R：5'-GAAGA CGCCAGTAGACTCCA)。按Trizol试剂盒说明书提取心肌组织总RNA，按TAKARA试剂盒将RNA逆转成cDNA存于-20℃冰箱。实时定量PCR在ABI 7500系统中进行聚合酶链反应。条件如下：起始退火温度95℃，进行30 s，然后按照95℃5 s，60℃45 s，共扩增40个循环。

2 结果

2.1 右美托咪定预处理对心肌梗死面积的影响 再灌注120 min后每组随机取5只大鼠心脏行心肌梗死面积检测，发现I/R组梗死面积为(41.5±2.9)%，DEXM组梗死面积为(30.8±3.1)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 右美托咪定预处理对心功能的影响 心导管记录三组动物缺血再灌注各时间点血流动力学参数见表1。造模前，Sham组、I/R组、DEXM组HR、LVDP、LVEDP、±dP/dt差异无统计学意义(P>0.05)。I/R组和DEXM组，缺血30 min及再灌注120 min时，HR、LVDP、±dP/dt均较缺血前及Sham组显著降低(P＜0.05)，LVEDP则显著升高(P＜0.05)。与I/R组相比，缺血30 min及再灌注120 min时，DEXM组LVDP、±dP/dt明显高于I/R组(P＜0.05)，LVEDP低于I/R组(P＜0.05)，见表1。

2.3 右美托咪定预处理对RyR2和SERCA2a的影响 再灌注120 min后取梗死周边区心肌组织，以实时定量PCR法测定RyR2、SERCA2a的mRNA表达水平。与Sham组比，I/R组和DEXM组心肌组织中RyR2和SERCA2a的mRNA水平均显著下降(P＜0.05)。与I/R组相比，DEXM组RyR2和SERCA2a的mRNA水平高于I/R组，见图1。

表1 各组大鼠不同时间点心功能指标比较(±s，n=10)

表1 各组大鼠不同时间点心功能指标比较(±s，n=10)

注：与同组缺血前及SHAM组同时间点比较，aP＜0.05；与I/R组同时间点比较，bP＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa。

组别Sham组I/R组DEXM组时间点缺血前缺血30 min再灌注120 min缺血前缺血30 min再灌注120 min缺血前缺血30 min再灌注120 min HR(bpm) 382±34 363±67 378±58 371±52 333±46a320±40a363±47 342±61a348±88aLVDP(mmHg) 126.5±21.6 121.4±18.8 120.3±22.5 128.6±18.9 68.4±25.5a61.0±16.3a 125.0±27.3 93.6±21.4ab100.8±26.2abLVEDP(mmHg) 8.4±2.5 8.0±1.9 8.7±2.7 9.0±3.8 14.3±2.7a16.9±3.4a8.7±2.5 11.3±2.1ab10.0±2.2ab+dP/dtmax(mmHg/s) 4511.2±473.7 4657.2±389.5 4804.5±440.6 4467.8±505.0 3689.6±465.1a3543.3±477.3a4735.5±543.8 4114.2±489.8ab4432.3±435.0ab-dP/dtmax(mmHg/s) 4317.6±392.8 4449.3±486.4 4630.2±511.2 4287.0±443.5 3435.0±457.9a3673.4±530.1a4540.3±476.6 4012.4±396.3ab4287.5±469.7ab

图1 各组间心肌组织RyR2和SERCA2a的mRNA水平

3 讨论

1986年有学者观察到缺血预处理，即在再灌注前反复短暂缺血，可以减小心肌梗死面积，减少再灌注心律失常，改善心功能。然而反复多次阻断冠状动脉势必增加血管损伤的风险，于是可发挥保护心脏作用的药物预处理成为防治缺血再灌注损伤的研究重点。右美托咪啶作为一种临床上广泛运用的新型镇痛麻醉药物，对心、脑、肾等多个脏器有广泛的保护作用[1]。研究表明右美托咪啶通过增强迷走神经兴奋性，降低心肌耗氧，改善血管舒缩功能，发挥保护心血管保护作用[2-3]。本研究建立缺血再灌注大鼠模型，以右美托咪啶预处理研究其心肌保护效应，发现右美托咪定可减小心肌梗死面积，改善心脏舒缩功能，可增加心肌组织RyR2和SERCA2a的mRNA表达水平，提示右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。

有研究发现右美托咪定可降低缺血-再灌注损伤大鼠心肌组织Toll样受体4/和NF-κB的mRNA表达，进而抑制炎症反应[4-5]。右美托咪啶亦可通过激活MEK/ERK1/2，PI3K/Akt信号通路，减轻心肌缺血再灌注损伤[6]。以右美托咪定预处理干预离体大鼠心脏缺血再灌注模型，发现右美托咪定可以改善线粒体功能，促进缺血前线粒体ATP敏感性钾通道，抑制再灌注早期线粒体渗透性转换孔的开发[7]。

RyR2和SERCA2a在心肌细胞钙循环及心肌收缩中发挥重要作用。钙离子经心肌细胞膜钙通道进入细胞内，与肌浆网RyR2结合，使钙离子从肌浆网释放，钙离子与肌钙蛋白结合引起心肌细胞收缩，完成兴奋-收缩耦联，然后细胞内钙离子被SERCA2a重新摄回入肌浆网，或被钠钙交换体泵出胞外，使心肌细胞进入舒张状态。缺血再灌注损伤引起RyR2和SERCA2a活性降低，诱发钙超载，加重心肌损伤[8]。本研究显示右美托咪定预处理，可以提高RyR2和SERCA2a的mRNA水平，抑制钙超载，进而减轻心肌损伤，改善心功能。

综述所述，右美托咪定预处理可发挥心肌保护作用，减轻缺血再灌注损伤，这一发现提示右美托咪定可更安全地用于临床麻醉中围术期的心肌保护。

[1]Cai Y,Xu H,Yan J,et al.Molecular targets and mechanism of action of dexmedetomidine in treatment of ischemia/reperfusion injury[J].Mol Med Rep,2014,9(5):1542-1550.

[2]Talke P,Chen R,Thomas B,et al.The hemodynamic and adrenergic effects of perioperative dexmedetomidine infusion after vascular surgery[J].AnesthAnalg,2000,90(4):834-839.

[3]Uysa HY,Tezer E,Türkoğlu M,et al.The effects of dexmedetomidine on hemodynamic responses to tracheal ntubation in hypertensive patients:A comparison with esmolol and sufentany[J].J Res Med Sci,2012,17(1):22-31.

[4]蒋 鹏,黄祥君,赵 明,等.盐酸右美托咪定对缺血-再灌注损伤大鼠心肌Toll样受体4/核因子-κB信号通路的作用[J].临床麻醉学杂志,2014,30(3):294-296.

[5]Guler L,Bozkirli F,Bedirli N,et al.Comparison of the Effects of Dexmedetomidine vs.Ketamine in Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury in Rats-Preliminary Study[J].Adv Clin Exp Med,2014,23 (5):683-689.

[6]Ibacache M,Sanchez G,Pedrozo Z,et al.Dexmedetomidine preconditioning activates pro-survival kinases and attenuates regional ischemia/reperfusion injury in rat heart[J].Biochim Biophys Acta, 2012,1822(4):537-545.

[7]姜翠翠,夏满莉,王 敏,等.右美托咪定预处理减轻离体大鼠心脏缺血/再灌注损伤的线粒体相关机制[J].浙江大学学报(医学版),2013,42(3):326-330.

[8]Singh RB,Chohan PK,Dhalla NS,et al.The sarcoplasmic reticulum proteins are targets for calpain action in the ischemic-reperfused heart[J].J Mol Cell Cardiol,2004,37(1):101-110.

Protective effects of dexmedetomidine preconditioning in rats with myocardial ischemia reperfusion injury and the effects on calcium regulatory proteins.

LI Xia1,2,PENG Bi-wen1,DONG Hang2.1.School of Basic Medical Sciences,Wuhan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA;2.Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective effects of dexmedetomidine preconditioning in rats with myocardial ischemia reperfusion injury and the effects of dexmedetomidine on myocardium ryanodine receptor (RyR2)and sarcoplasmic reticIlum Ca2+-ATPase(SERCA2a).MethodsForty-five rats were randomly divided into three groups,sham operation group(Sham group),ischemia-reperfusion group(I/R group)and dexmedetomidine preconditioning group(DEXM group).2 h before left anterior descending coronary artery clamped,DEXM group received dexmedetomidine 100 μg/kg by intraperitoneal injection.The hemodynamic parameters were measured at the time of ischemia 30 min and reperfusion 120 min.The infarct size of myocardial tissues was determined by TTC staining.The mRNA level of RyR2 and SERCA2a were detected by the Real-time PCR.ResultsThe infarct size was (41.5±2.9)%in I/R group,which was significantly higher than(30.8±3.1)%in DEXM group(P＜0.05).Compared with the Sham group and the baseline before ischemic,heart rate(HR),left ventricular diastolic pressure(LVDP)and±dP/ dt decreased and the left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)increased in both I/R group and DEXM group at the time of ischemia 30 min and reperfusion 120 min(P＜0.05).Compared with the I/R group,LVDP and±dP/dt were higher,and LVEDP was lower in the DEXM group.Compared with the Sham group,the mRNA level of RyR2 and SERCA2a were smaller in the I/R group and DEXM group,which were higher in DEXM group than in I/R group.ConclusionDexmedetomidine preconditioning could attenuate myocardial ischemia reperfusion injury in rats via decreasing infarct size,improving cardiac function and increasing the mRNAlevel of RyR2 and SERCA2a.

Dexmedetomidine;Preconditioning;Ischemia reperfusion injury

R542.2

A

1003—6350（2015）18—2668—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0971

2015-03-14)

董 航。E-mail：donghang83@126.com