裂片石莼多糖微波辅助提取工艺优化及其卷烟保润应用

杨 君，黄芳芳，秦敏朴，邵 平，孙培龙

(1.浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江杭州310008;2.浙江工业大学海洋学院，浙江杭州310014)

石莼(Ulva fasciata)又名海白莱、海莴苣，属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属，常见种类主要有孔石莼、石莼、裂片石莼等，广泛分布于西太平洋沿海地区，浙江沿海石莼资源丰富，是中国野生海藻类中极为丰富的一种资源［1］。近年来，随着海洋生物的开发利用，海藻的生物活性及药用价值被逐渐研究与发现，其中对海藻多糖的研究最为突出。海藻多糖是藻体主要成分，约占其干质量的20% ～70%。研究表明，海藻多糖具有降血脂［2］、调节免疫［3］、抗肿瘤［4］、抗病毒［5］等多种生理活性，还有作为药物或药物中间体的潜能［6］，在食品、有机肥料、化妆品等领域，体现出巨大的应用潜力和极高的经济价值［7］。

微波辅助提取是微波和传统水提法相结合的一种有效的提取方法。它可以促进细胞壁和细胞膜破碎，有利于细胞内物质的渗出，能有效缩短提取时间及提高多糖的提取率，同时具有设备简单、适用范围广、污染小等特点［8-9］。杨俊红等［10］对比了中草药中有效成分的不同提取方法，MINOO等［11］用微波辅提法(MAE)从茜草科植物中提取茜草素和紫红素，结果均表明:MAE效果明显优于传统的提取方法。卷烟的干燥感问题一直制约中式卷烟的发展，需要在烟草中加入保润剂。海藻多糖中含有大量的羟基，能与水分子形成化学键，具有一定的吸湿作用。

目前对裂片石莼多糖方面的研究报道不多，本研究以裂片石莼为原料，以多糖提取率为指标，在单因素试验的基础上，运用响应曲面法优化裂片石莼多糖微波辅助提取的工艺条件，并研究其吸湿保湿性能，制备样品卷烟进行综合感官评吸，从而为海洋海藻资源的综合开发和利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

1.1.1.1 裂片石莼:采自浙江温州平阳县南麂列岛，经过淡水反复冲洗，阴干，放入60℃烘箱中烘干并粉碎，干燥保存备用。烟丝:由浙江中烟工业有限责任公司提供。

1.1.2 试剂 质量分数6%苯酚、浓硫酸(分析纯)，葡萄糖标准品、无水乙醇、蒸馏水、结晶苯酚、NaOH溶液、氯仿、正丁醇，样品试剂均为分析纯。

1.2 设备与仪器

灵巧型粉碎机，DJ-04型，上海淀久仪器公司;微波萃取仪，上海新仪微波化学科技有限公司;电子天平，PL602型，梅特勒—托利多仪器有限公司;紫外—可见分光光度计，752型，上海光学仪器有限公司;冷冻离心机，HITACHI CR21GII型，日本日立公司;冷冻干燥机，ALPHA 2-4LD PLUS型，德国Marin Christ公司;恒速搅拌器，S-212型，上海申胜生物技术有限公司;磁力搅拌器，85-1型，杭州大卫科教仪器有限公司;三频恒温数控超声波清洗器，KQ-300GVDV型，昆山市超声仪器有限公司;旋转蒸发器，RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂;数显恒温水浴锅，HH-2型，荣华仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖提取工艺流程 取适量裂片石莼粉末，按一定料液比加入蒸馏水，按照设定的参数进行微波辅助提取。提取完成后冷却静置1 h，然后以 10 000 r·min-1、4 ℃ 冷冻离心 10 min，得上清液和沉淀。取上清液，旋转蒸发浓缩至适当浓度，加入体积分数95%乙醇溶液，使样品最终乙醇体积分数为80%，放置过夜，离心得沉淀，加入少量蒸馏水使沉淀溶解，并将残留的少量酒精完全蒸发，冷冻干燥得裂片石莼粗多糖。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制 精确称取烘干至恒重的葡萄糖0.500 0 g，加水溶解后，定容至100 mL，再取出溶液1 mL到50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于试管中，各以蒸馏水补足至2 mL，然后加入1.0 mL质量分数6%苯酚及5.0 mL浓硫酸，振荡混匀后，置沸水浴中加热15 min，取出置冰水中迅速冷却后于490 nm测吸光度，以2.0 mL水按同样显色操作作为空白。以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，得标准曲线，并计算标准曲线的回归方程。

标准曲线的回归方程 Y=0.5741X+0.0393，R2=0.998 7.

样品液中多糖含量的测定方法同上(2 mL样品液替代2 mL葡萄糖标准溶液)。

多糖的测定采用苯酚-硫酸法［12］。

1.3.3 粗多糖得率计算公式 多糖提取率=(m1×D×V/m2)×100%

式中:m1为样品液OD值对照标准曲线所得糖质量;D为稀释倍数;V为样品液总体积(mL);m2为原料的质量。

1.3.4 单因素分析 分别以微波功率、料液比、提取时间为单因素进行试验，探讨其对裂片石莼多糖提取率的影响。

1.3.5 响应面法优化裂片石莼多糖微波提取 在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken试验设计原理［12］，选择微波功率、料液比、提取时间进行三因素三水平的中心组合试验，利用Design-Expert 7.0软件进行响应面分析，得到17组试验，确定微波法提取裂片石莼多糖的最佳工艺条件。因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.6 验证试验 在最佳提取工艺条件下，进行5次裂片石莼多糖的提取，测定提取率，并验证其结果与Design-Expert软件优化出来的多糖提取率的拟合情况。

1.3.7 裂片石莼多糖保润性能测定 样品前处理:将卷烟烟丝在温度(22±1)℃，相对湿度60% ±2%条件下平衡48 h。取120 g平衡后的烟丝，分为2份，其中1份喷洒体积分数0.1% 裂片石莼多糖提取液，另1份喷洒等量的蒸馏水，然后于温度(22±1)℃，相对湿度60% ±2% 条件下平衡48 h。

烟丝的吸湿保湿性能测定:将平衡后的烟丝分别置于温度(22±1)℃、相对湿度40% ±2%和温度22±1℃、相对湿度80% ±2%的硫酸干燥器中。将每次取出的样品(烟丝+称量瓶)进行称量(精确至0.000 1 g)，前2 d每天取样2次，之后每天取样1次，至质量恒定。根据样品起始含水率和各时间点样品与起始样品的质量差计算样品的即时含水率。每组测得的2份数据取平均值。即含水率W计算公式如下:

式中:W为试样的水分质量分数，%;m0为称量皿质量，g;m1为烘干前称量皿和试料总质量，g;m2为烘干后称量皿和试料总质量，g。

初始含水率测定:将上述烟丝烘干至恒重，按照烘箱法测量其含水率，即为初始含水率。

1.3.8 样品烟感官评定 空白烟丝平衡→添加裂片石莼多糖提取液或蒸馏水→样品烟丝平衡→打制成卷烟→烟支平衡

空白烟丝平衡:取14 g烟丝在恒温恒湿箱温度保持在(22±1)℃，相对湿度保持在60% ±2%)内平衡48 h;

多糖溶液的喷洒:取平衡后的烟丝分为2份，其中1份喷洒体积分数0.1%裂片石莼多糖提取液，另1份喷洒等量的蒸馏水。

样品烟丝平衡:将添加裂片石莼多糖和蒸馏水的烟丝在温度(22±1)℃，相对湿度60% ±2%下平衡48 h。

卷烟的打制:用卷烟器手动卷烟，每支卷烟保持在0.7 g烟丝，烟丝分布均与，软硬适中。

烟支平衡:将制备好的卷烟置于温度(22±1)℃，相对湿度60% ±2%下平衡48 h。

将制备好含有裂片石莼多糖和蒸馏水的卷烟送往浙江中烟公司，让专业评吸人员进行综合感官评吸，得到评吸结果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 微波功率对裂片石莼多糖提取率的影响 准确称取5 g裂片石莼样品，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸馏水，分别在不同功率 300、400、500、600、700 W下微波处理5 min，然后取出冷却静置1 h，以转速10 000 r·min-1、温度4℃冷冻离心10 min，得上清液和沉淀。取上清液，旋转蒸发浓缩至适当浓度，加入体积分数95%乙醇溶液使样品最终乙醇体积分数为80%，放置过夜，离心得沉淀，加入少量蒸馏水使沉淀溶解，并将残留的少量乙醇完全蒸发，冷冻干燥得裂片石莼粗多糖。所有试验平行做3组，取平均值。

由图1可知，不同的微波功率对裂片石莼多糖提取率的影响较为显著。多糖提取率随着微波功率的增加显著提高，这可能是由于微波功率对海藻细胞壁的破坏作用增强，使得多糖从细胞中流出［13］。当微波功率达到400 W时，试验测得多糖提取率最大，为15.83%。而微波功率超过400 W后，多糖提取率呈现明显下降趋势，可能是微波对海藻细胞的破坏作用超过极限，从而引起细胞内多糖的降解［14］，导致多糖提取率逐渐下降。尤其是当微波功率升高到700 W时，多糖提取率明显下降，仅为9.43%。因此选择最佳微波功率为400 W。

图1 微波功率对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取时间对海藻多糖提取率的影响 准确称取5 g裂片石莼样品于三角瓶中，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸馏水，于微波功率400 W时分别依次萃取5、10、15、20、25 min，然后取出。其后步骤同上。所有试验平行做3组，取平均值。不同的微波时间对海藻裂片石莼的多糖提取率的影响如图2所示。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

由图2可得，不同的提取时间对多糖提取率的影响也较为显著。随着提取时间的增加，裂片石莼海藻多糖的提取率显著提高，在10 min时的效果最佳，提取率达到最大，为14.29%。继续增大提取时间，多糖提取率开始下降，尤其是在15～20 min时提取率快速下降。当提取时间为20 min时，多糖提取率仅为8.43%，其原因可能是由于微波提取时间过长，辐射能对海藻细胞的作用过度而导致多糖的降解，从而使提取率下降［14］。此外，过长的微波时间作用，也可能会导致杂质与目标物多糖相结合，冷冻离心过程中多糖可能随着杂质被一同除去而造成多糖量的损失［15］，使提取率下降。综合考虑提取率和能耗，选择最佳提取时间为10 min。

2.2.3 料液比对海藻多糖提取率的影响 准确称取一定量的海藻样品，加入100 mL蒸馏水，使最终料液比分别为1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100(g∶mL)，混匀，在微波功率400 W、提取时间10 min下分别进行萃取，然后取出。其后步骤同上。所有试验平行做3组，取平均值。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of material solvent ratio on polysaccharide extraction rate

裂片石莼是一种含水率较少的藻类植物，故其多糖提取率可能会受到料液比的影响比较大。由图3可知，随着料液比的不断增大，多糖提取率整体呈现下降趋势。当料液比逐渐增大时，多糖提取率先上升(料液比1∶60(g∶mL)，然后急剧下降。而当料液比达到1∶100(g∶mL)时，多糖得率反而稍微有所上升，其原因可能是对于一定量的裂片石莼粉末，水溶液的增加可以增加质量浓度差以及加大固液接触的面积，有利于提高溶质的扩散速度。但是考虑到后续工序中有浓缩等加工步骤［16］，加水量过高(即料液比过大)会给试验带来不便，使后续步骤变得繁琐，所以综合考虑后，暂定最优料液比为 1∶20(g∶mL)。

2.3 裂片石莼多糖提取工艺响应面优化设计与分析

2.3.1 回归模型的建立与分析 根据 Box-Benhnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验的结果，选取影响裂片石莼多糖提取率的主要因素，以微波功率(A:300、400、500 W)、提取时间(B:5、10、15 min)和料液比(C:1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL))3因素为自变量，多糖提取率Y(%)为响应值，设计了三因素三水平的试验，利用响应面分析优化多糖提取的工艺参数。

2.3.2 试验结果与数据分析 本研究的响应面试验结果如表2所示。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Results of response surface experiments

根据单因素试验确定自变量，分别为微波功率、提取时间和料液比，以裂片石莼多糖提取率为响应值，利用Design Expert 7.0软件对设计表进行多元回归拟合，得到裂片石莼多糖提取率(Y)对微波功率(A)、提取时间(B)、料液比(C)的二次多项回归模型方程:

Y=16.29-0.59A-0.22B-0.57C-0.49AB+0.14AC+0.24BC-2.62A2-0.36B2-1.07C2

表3 微波辅助提取裂片石莼多糖的响应面试验方差分析表Table 3 Analysis results of variance table of microwave-assisted extraction about polysaccharides from Ulva fasciata

从表3可知，对多糖提取率影响明显的是A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2，影响大小依次为微波功率、料液比和提取时间，即微波功率的影响最为显著，料液比对提取率的影响与微波功率相近，而提取时间最不显著。

图4 Y=f(A，B)的响应面和等高线图Fig.4 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

图5 Y=f(B，C)的响应面和等高线图Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

由上述的回归分析结果可知，图4、图5分别为(A，B)、(B，C)的响应面曲线图和等高线图，以研究微波功率(A)、提取时间(B)和料液比(C)等因素对多糖提取率的影响。

图4中可见，各响应面曲线图能够较为直观地反映出各个试验因素对响应值的影响。而对比各因素的等高线图可发现，(A，B)及(B，C)则表现有较好的交互作用，即其等高线图的椭圆程度相对较高。同时该曲线上的最高点，也正是等值线中的面积最小的椭圆中心点，都反映在响应面曲面图和等高线上，即各图中在响应面曲线的最高点和等高线上均存在有“极限值”。对上述图进行分析可得，微波功率(A)对裂片石莼多糖提取率的影响最为明显，表现为曲线的倾斜率最大;其次是料液比(C)，该曲线的倾斜率也较大;而提取时间(B)则比较小。

2.3.3 裂片石莼多糖最佳提取条件的确定和验证试验 根据Design Expert 7.0软件得到的试验模型，可预测出在理论条件下的最佳工艺条件:微波功率 391.09 W、提取时间 8.27 min、料液比1∶26.92(g∶mL)，其相应的裂片石莼多糖提取率为16.44%。若考虑到实际操作的便利性及可行性，可将最优值修正为微波功率400 W、提取时间8 min、料液比 1∶25(g∶mL)。5次多糖提取率为:16.35%、16.29%、16.51%、16.42%、16.26%，平均值为16.37%，与预测值(16.44%)偏差较小，相对误差为1.66%，说明该回归方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对微波法提取裂片石莼多糖的工艺进行回归分析和参数优化。

2.3.4 裂片石莼多糖对烟丝保润性能的影响 为考察裂片石莼多糖的保润性能，对添加裂片石莼多糖的烟丝及其空白对照烟丝在温度(22±1℃)、相对湿度40% ±2%和温度(22±1℃)、相对湿度80%±2%条件下的解湿和吸湿情况进行了测试。结果显示:在低湿条件下(图6)，空白对照烟丝的含水量下降快于添加裂片石莼多糖的烟丝，在80 h内，即时含水率下降较快，之后曲线较为平缓;在高湿条件下(图7)，空白对照烟丝的含水率增加高于添加裂片石莼多糖的烟丝，在50 h内，含水率上升较明显，之后趋于平缓。综上所述，裂片石莼多糖具有一定的保润和防潮功能，在低湿条件下具有相对较慢的解湿速率，而在高湿条件下具有相对较低的吸湿速率。

图6 烟丝在低湿条件下含水率随时间的变化Fig.6 The moisture retentivity in low humidity condition in tobacco

图7 烟丝在高湿条件下含水率随时间的变化Fig.7 The moisture retentivity in high humidity condition in tobacco

2.3.5 裂片石莼多糖对烟丝的感官评定影响 为考察裂片石莼多糖的保润性能，对添加裂片石莼多糖的烟丝及其空白对照烟丝，由5位浙江中烟工业责任公司烟草专业资质评吸人员进行综合感官评吸。结果表明:添加了提取液的烟丝烟气总体提升，外加物质香气较显著，透发性变好，烟气变细腻，干燥感有改善，对于卷烟感官清爽度、舒适度的提高具有一定作用。刺激性降低，特别是口腔、鼻腔的刺激性，整体下降较为明显，细腻度、柔和度、圆润感3指标都有上升，因此该组分的多糖添加到烟丝中能较好地改善吸食的口感。

3 讨论

利用Design Expert软件设计三因素三水平中心组合试验，采用响应面对微波法提取裂片石莼多糖的工艺条件进行了优化分析，建立了二次多项式数学模型，经检验该数学模型合理可靠，能够较好地预测裂片石莼多糖的提取率。根据方差分析和回归方程的响应面及等高线图可知，微波功率、提取时间、料液比对多糖提取率的影响显著。多糖的最佳提取工艺条件为:微波功率400 W、提取时间8 min、料液比 1∶25(g∶mL)，此工艺的多糖实际提取率为16.37%，与理论预测值16.44%相差较小，说明该回归方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面适用于对微波法提取裂片石莼多糖的工艺进行回归分析和参数优化;经专业评吸人员对添加裂片石莼多糖的烟丝及其空白对照烟丝进行综合感官评吸，证明该组分的多糖添加到烟丝中能较好地改善吸食的口感。此外，本试验还表明裂片石莼多糖能够在低湿条件下降低烟丝的失水率和失水速率，在高湿条件下有效地减缓烟丝对水分的过量吸收，具有一定的保润、防潮功能。

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