蟛蜞菊烯酸钠盐抑制植物病原真菌菌丝生长活性研究

李守婷，周 艳，麻兵继，阮 元，李 文

(河南农业大学农学院，河南郑州450002)

蟛蜞菊烯酸(grandiflorenic acid，GA)是一个贝 壳杉烷型二萜化合物，这类二萜化合物在香茶菜属植物中分布广泛［1-2］。研究表明，贝壳杉烷型二萜化合物具有多种药理活性，如抗肿瘤［3］，抗感染［4］、抗氧化［5］和抗病毒等［6］。最新的文献报道表明，贝壳杉烷型二萜化合物同样具有显著的抗植物病原真菌和细菌的作用［7-8］。20世纪70年代，南美叶蟛蜞菊(Werneria ciliolata)作为一种地被植物引入中国。该植物具有较强的繁殖特性，也有研究显示其对其他植物有化感作用，因此往往形成单一的群落，并且不断蔓延，逐渐成为中国主要的入侵物种之一［9］。为开发利用南美叶蟛蜞菊植物资源，作者对其进行了系统的化学成分研究，分离鉴定出一系列的贝壳杉烷型二萜化合物，其中蟛蜞菊烯酸的含量最丰富［10］。然而，蟛蜞菊烯酸的极性很小，常温下不易溶于水。为提高蟛蜞菊烯酸水溶性，并探讨该化合物在生物农药方面开发的可能性，本试验首次利用化学方法合成了蟛蜞菊烯酸钠盐化合物(GA-Na)，进而利用PDA平板抑菌试验方法筛选了该钠盐化合物对18种植物病原真菌菌丝生长抑制活性。另外，为了观察蟛蜞菊烯酸钠盐化合物对病原真菌菌丝形态结构的影响，本研究根据前期抑菌试验结果，选取抑菌活性较强且菌丝生长周期短、生产上危害性大的小麦赤霉菌为代表真菌，利用显微镜观察药物处理后的菌丝形态变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试药物蟛蜞菊烯酸系河南农业大学农学院中药化学实验室自制，纯度为95%以上。油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、烟草蛇眼菌(Alternaria pluriseptata)、玉米穗腐菌(Fusarium verticillioides)、茄子茎枯菌(Fusarium oxysporum f.sp.)、花生黑斑菌(Cercospora personata)、番茄早疫菌(Alternaria solani)、茄子绵疫菌(Phytophthora melongenae)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、茶炭疽菌(Gloeosporium theae-sinensis)、玉米圆斑菌(Bipolaris carbonum)、苹果炭疽菌(Glomerella cingulate)、烟草低头黑菌(Colletotrichum capsici f.nicotianae)、葡萄柄孢菌(Cladosporium ladosporium sp.)、花生褐斑菌(Cercospora arachidicola)、柑橘炭疽菌(Colletotrichum gloeosprioides)、板栗炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides sp.)和牡丹炭疽菌(Gloeosporium sp.)等18种供试菌种均由河南农业大学农学院中药化学实验室提供并保存。

化合物氢谱和碳谱核磁共振数据由Bruker AM-400测定，四甲基硅烷(TMS)为内标，耦合常数为Hz，化学位移值为×10-6。检测用薄层层析材料GF254由青岛海洋化工厂生产。

1.2 蟛蜞菊烯酸钠盐的制备

蟛蜞菊烯酸钠盐的制备参照文献［8］的方法:在50 mL圆底烧瓶中加入300 mg蟛蜞菊烯酸(1 mmol)，再加入10 mL环己烷溶解。待蟛蜞菊烯酸完全溶解后，加入10 mL 0.5 mol·L-1NaOH 溶液，磁力搅拌，60℃水浴反应1 h。反应过程中用GF254薄层板每隔20 min检测1次。待反应完全后，用布氏漏斗抽滤，除去溶剂。布氏漏斗中的剩余物反复用冷水清洗以除去杂质，最后得到蟛蜞菊烯酸钠盐化合物(210 mg，0.65 mmol)。1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ ppm 5.24(t，J=3.2 Hz，H-11)，4.91(s，H-17a)，4.80(s，H-17b)，1.22(s，H-18)，1.02(s，H-20);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ ppm 40.6(C-1)，20.2(C-2)，38.5(C-3)，44.5(C-5)，18.8(C-6)，41.8(C-7)，43.1(C-8)，155.8(C-9)，39.2(C-10)，114.6(C-11)，37.8(C-12)，42.2(C-13)，44.3(C-14)，50.0(C-15)，158.8(C-16)，105.5(C-17)，28.7(C-18)，182.1(C-19)，23.2(C-20)。

1.3 蟛蜞菊烯酸钠盐抗菌谱测定

参照文献［11］方法，精确称取蟛蜞菊烯酸钠盐化合物和多菌灵，用少量无菌水溶解并定容至所需质量浓度。用无菌PDA培养基分别制作质量浓度为 0.50，0.25，0.125 g·L-1的 GA-Na 和多菌灵带药培养基，用等量灭菌的无菌水加入PDA中作空白对照，倒入无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后，用无菌打孔器取直径6 mm菌饼，接种于带药培养基平板中央，放入26℃恒温培养箱中培养4～7 d，取出培养皿并测量菌丝生长直径/mm，按下式计算菌丝生长抑制率(I)。每个药物质量浓度重复3次，取平均抑制率。

1.4 小麦赤霉菌菌丝培养及显微结构观察

小麦赤霉菌在空白PDA培养基平板上培养5 d，待菌丝生长覆盖整个平板后，用无菌打孔器取直径9 mm的菌饼接到250 mL液体PDB培养基中。于28℃，180 r·min-1振荡箱中继续振荡培养小麦赤霉菌24 h后，设处理组和空白对照组。处理组加入一定量的蟛蜞菊烯酸钠盐化合物，使培养基药液质量浓度为0.50 g·L-1，空白对照组加灭菌的重蒸水。继续培养48 h后分别再将菌丝充分去除培养基后取微量菌丝在显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 蟛蜞菊烯酸钠盐抗菌谱测定结果

蟛蜞菊烯酸钠盐化合物对18种植物病原真菌的菌丝生长抑制活性如表1所示。由表1可以看出，总体而言，蟛蜞菊烯酸钠盐化合物呈现出显著的、广谱的抗菌效果，并具有较好的量效关系。相同质量浓度下，蟛蜞菊烯酸钠盐化合物对于部分病原真菌的抑菌效果比多菌灵还要强。在0.50 g·L-1质量浓度下，蟛蜞菊烯酸钠盐化合物对油菜菌核菌、西瓜炭疽菌、烟草蛇眼菌、玉米穗腐菌、茄子茎枯菌、花生黑斑菌和番茄早疫菌的抑制效果超过60%，其中，油菜菌核菌和西瓜炭疽菌对药物敏感，抑制率高达98.0%和80.6%，抑菌效果接近相同质量浓度的多菌灵;对10种病原真菌茄子绵疫菌、小麦赤霉菌、茶炭疽菌、玉米圆斑菌、苹果炭疽菌、烟草低头黑菌、葡萄柄孢菌、花生褐斑菌、柑橘炭疽菌和板栗炭疽菌显示出中等抑菌作用，抑菌率超过40%。蟛蜞菊烯酸钠盐化合物在0.50 g·L-1质量浓度条件下仅对牡丹炭疽菌的抑制效果较弱，但抑菌率也达到了35.9%。

表1 蟛蜞菊烯酸钠盐和多菌灵对18种病原真菌的抑菌率Table 1 The inhibitory effect of GA-Na and carbendazim on 18 pathogenic fungi %

蟛蜞菊烯酸钠盐化合物在0.25 g·L-1质量浓度下对油菜菌核菌、烟草蛇眼菌和玉米穗腐菌显示很好的抑菌效果，抑制率超过60%，对另外11种病原真菌显示中等强度的抑菌效果(抑制率超过40%)。随着蟛蜞菊烯酸钠盐化合物药物质量浓度的下降，其抑菌效果也逐渐下降。在0.125 g·L-1质量浓度下，蟛蜞菊烯酸钠盐化合物仅对油菜菌核菌显示显著的抑菌作用，对烟草蛇眼菌等10种病原真菌显示中等强度的抑菌效果。另外，在0.125 g·L-1质量浓度下，阳性对照药多菌灵虽然对油菜菌核菌、西瓜炭疽菌、玉米穗腐菌、茶炭疽菌、苹果炭疽菌、烟草低头黑菌和板栗炭疽菌7种病原真菌有很好的抑制效果，但对其他11种病原真菌几乎没有明显的抑制效果。

图1 蟛蜞菊烯酸钠盐对小麦赤霉菌菌丝形态结构的影响Fig.1 Effects of GA-Na on the morphology structure of F.graminearum

2.2 蟛蜞菊烯酸钠盐对小麦赤霉菌菌丝形态结构的影响

分别将少量小麦赤霉菌空白组菌丝和蟛蜞菊烯酸钠盐化合物处理组菌丝放在显微镜下进行观察，结果如图1所示。通过显微观察，发现空白组菌丝生长稠密，药物处理组菌丝体生长稀疏，菌丝体数量减少，分支较少;通过高倍镜观察，发现空白组菌丝体粗大饱满，分支明显，药物处理组菌丝纤细，分支较弱。说明蟛蜞菊烯酸钠盐化合物对小麦赤霉菌菌丝的生长发育具有明显的抑制作用。

3 讨论

由于蟛蜞菊烯酸化学结构中极性取代基少，导致水溶性很差，常温下在水中几乎不溶解。本试验通过制备蟛蜞菊烯酸的钠盐化合物，改善了其水溶性。参考文献［12］的方法，测定了蟛蜞菊烯酸钠盐化合物在25℃下水中的溶解度大约为6 g·L-1。在含药PDA平板制作过程中基本没有药物的析出，保证了抑菌试验结果的可靠性。蟛蜞菊烯酸的钠盐化合物在0.50和0.25 g·L-1质量浓度下对多种常见植物病原真菌菌丝生长抑制效果显著，部分病原真菌如烟草蛇眼菌、茄子颈枯菌、花生黑斑菌、番茄早疫菌、茄子绵疫菌等的抑菌效果超过相同质量浓度的阳性对照药多菌灵，表明该化合物具有广谱的抗病原真菌作用。但随着蟛蜞菊烯酸的钠盐化合物质量浓度的下降，其抗菌效果也下降，0.25 g·L-1质量浓度下仅对油菜菌核菌抑制率超过60%。另外，显微观察试验选取小麦赤霉菌为代表真菌是因为该病原真菌生长周期短，在固体PDA平板上一般4～5 d即可长满平板，接种到液体PDB培养液中一般生长3～4 d即可达到最大生物量。为了观察到明显的药物抑菌效果，在液体PDB培养液中加入了较高质量浓度的蟛蜞菊烯酸的钠盐化合物，即0.50 g·L-1。显微观察结果表明，蟛蜞菊烯酸的钠盐化合物对小麦赤霉菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，菌丝的分化也受到明显抑制。然而，该化合物对病原真菌的具体抗菌作用靶点及作用机制仍需进一步明确，大田药效仍需进一步试验验证。

近年来随着化学合成农药在生态环境中造成的危害日趋严重，环境友好型的生物农药的研发日益受到人们的重视。当前部分植物源生物农药已成功开发上市，如苦参碱制剂、除虫菊酯制剂、鱼藤酮制剂等［13］。本试验所用的蟛蜞菊烯酸直接从南美蟛蜞菊中提取，在植物体内含量较丰富，具有一定的深入开发价值。本试验通过制备蟛蜞菊烯酸钠盐化合物改善水溶性，进而研究其抗病原真菌活性，将为下一步充分利用南美蟛蜞菊及其代谢产物蟛蜞菊烯酸在生物农药方面的开发应用奠定基础。

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