过量氟对成骨细胞非折叠蛋白反应的影响*

张亚楼，李甜，王洪波，陈龙，钟近洁

（新疆医科大学基础医学院 组胚教研室，新疆 乌鲁木齐830011）

内质网应激反应是氟骨症发生、发展作用机制之一[1]。钙连接蛋白（Calnexin，CNX）/钙网蛋白（Calreticulin,CRT）循环是真核细胞内负责糖蛋白折叠质量的主要监控机制。内质网中错误折叠的蛋白可以通过这两种分子伴侣CNX/CRT循环重新折叠，而对于不能正确折叠的蛋白，则由内质网相关性降解蛋白（ER degradation enhancing mannosidase like protein，EDEM）转运至胞浆被蛋白酶体降解。内质网应激引起内质网功能障碍时，CNX/CRT循环发生异常，错误折叠的糖蛋白在内质网中堆积导致细胞功能障碍。课题组前期已发现氟能直接引起成骨细胞内质网应激[2]，而关于过量氟作用下成骨细胞内这2种重要的分子伴侣表达的研究尚未见报道。生长停滞与DNA损害可诱导基因34（growth arrest and DNA damage-inducible gene 34，GADD34），在DNA损害、细胞周期停滞及内质网功能障碍等情况下可表达上调[3]。而氟中毒条件下GADD34的表达情况未见报道。通过了解糖蛋白CNX/CRT及GADD34表达情况并同时分析内质网应激标志分子——免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BIP），也称葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）的表达，有助于理解内质网应激在成骨细胞染氟后的意义，对进一步设计/开发针对氟骨症诊断和治疗的分子靶标，有重要的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人骨肉瘤Saos-2细胞购于中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清（LIFE公司）的DMEM培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行贴壁培养，每2～3天根据细胞生长的密度和培养液酸碱度的变化更换培养液，当细胞汇合度达到80%进行传代培养。

1.2 细胞染氟模型

Saos-2细胞处于对数生长期时，氟化钠NaF（分析纯，上海生工生物工程技术有限公司）用培养液配制，浓度分别为5（F-2.26 mg/L）、10（F-4.52 mg/L）、20（F-9.04 mg/L）和40 mg/L（F-18.08mg/L），同时设立无氟空白对照。染氟时间为24 h。实验中所用一抗BIP、CNX、CRT、GADD34、β-actin均 购 自Cell Signaling公司，应用时1︰1 000稀释。羊抗兔HRP二抗、羊抗鼠HRP二抗购自武汉博士德。

1.3 成骨细胞内蛋白表达检测

成骨细胞内蛋白表达检测采用免疫印迹技术，RIPA液提取总蛋白。Bradford法检测蛋白浓度。取30μg蛋白质，与5×上样缓冲液混合，100℃变性10min。各种一抗以1︰1 000稀释。12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转印至PVDF膜，ECL显影，凝胶成像系统扫描。通过软件测定其灰度值，同一样本检测蛋白与β-actin灰度比值作为该样本蛋白的相对量，用于分析。每种蛋白重复检测至少2次。

2 结果

免疫印迹结果显示CRT、CNX和BIP蛋白在Saos-2细胞内均有表达，而且3种蛋白表达各自呈现一定规律（见图1A）。氟引起Saos-2细胞内CRT蛋白表达变化在受试时间点基本一致，仅在NaF 20和40mg/L时表达轻微上调，20mg/L时表达最高，为对照组的1.6倍（P<0.05）（见图1B）。CNX在NaF 5、10和20mg/L时蛋白表达水平低于对照组，但有逐渐上升的趋势。其中5和10mg/L的表达与对照相比，差异有统计学意义（P<0.05）。而40mg/L时蛋白表达水平为染氟细胞组中最高，但仅比对照组略高，差异无统计学意义（P>0.05）（见图1C）。随着染氟剂量的增加，BIP的表达在5和40mg/L呈现明显的升高，4个剂量组的表达水平均高于对照组，尤其是NaF 20和40 mg/L两组蛋白表达高于对照组近3倍。BIP的表达水平和变化趋势与CNX基本一致（见图1D）。

图1 CRT、CNX和BIP蛋白在Saos-2细胞内均有表达

在各剂量组的Saos-2细胞内GADD34蛋白均未见表达，而且在宫颈癌Hela细胞中也未见表达，而在小鼠脑组织中呈现强阳性表达。见图2。

CRT、CNX、BIP和DADD34 4种分子伴侣间的关系经QIAGEN公司在线软件（http：//gncpro.sabiosciences.com/gncpro/gncpro.php）绘制（见图3）。BIP可与CNX、CRT共表达；CNX与CRT之间存在物理相互作用。以上3种分子伴侣可以通过其他的分子伴侣如ATF4、ATF6、XBP1等使GADD34受到影响。

图2 GADD34在Saos-2细胞中不表达

图3 4种分子伴侣间的相互作用关系

3 讨论

内质网（endoplasmic reticulum,ER）是蛋白质合成与分泌的重要场所。当细胞受到外界的某些刺激时，ER会产生一系列调节机制，形成内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。内质网应激时首先引发恢复机制，通过未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR）缓解内质网应激；如果长时间不能完全缓解UPR引起的细胞毒性作用时，可以引起细胞凋亡[4]。内质网应激触发的未折叠蛋白反应通过关闭蛋白翻译、促进分子伴侣表达、促进错误折叠蛋白的转运与降解等机制降低内质网负荷。内质网应激在染氟前期的发生、发展中起到重要作用。

CRT位于内质网腔内，在协助蛋白质正确折叠、调解钙离子稳态中起重要作用，表达缺失时可以损害蛋白和糖蛋白的质量控制，该分子适度的表达上调可能增强成骨细胞抗损伤的能力[5]。细胞内钙超载参与氟骨症发病机制并起着重要的作用[6]。在本研究中，除了NaF 20mg/L组（此时F-9.04mg/L）增高外，其余组表达基本稳定，显示其在减轻细胞内钙超载反应较弱，未能起到保护作用。

CRT和CNX的底物不同，功能也不相同[7]。本研究结果显示CNX蛋白的表达水平在染氟成骨细胞中明显降低，且和染氟剂量相关。本研究中在5和10mg/L时成骨细胞内质网应激标志分子BIP虽然增高，但差异无统计学意义，内质网应激尚处于可控制阶段。此后随氟剂量的增加，CNX代偿性增加，以发挥其分子伴侣功能及调节钙稳态、对抗氧化应激的功能。CNX在NaF引起的成骨细胞内质网应激较强时（NaF 40mg/L），蛋白表达量上调，可以增强内质网的蛋白质承载能力。本研究的结果表明，CNX参与了过量氟对成骨细胞前期的病理生理过程，提示CNX/CRT可能是氟中毒发病的又一重要机制。

BIP的过量表达能够减轻成骨细胞中由氟引起的内质网应激，从而减缓UPR。同时BIP的高表达能够诱导磷酸钙的形成，促进骨细胞的矿化[8]，这个可能与氟骨症患者中经常可以见到的骨硬化现象有关。

GADD34在DNA损害、细胞周期停滞及内质网功能障碍等情况下可表达上调[9]。已有报道，氟可以引起成骨细胞周期停滞，进而致细胞凋亡[10]。对GADD34的研究有助于进一步理解氟对成骨细胞造成内质网应激后，对细胞周期的影响方式及途径。本研究中未见此蛋白表达，今后可以在其他细胞如原代培养的成骨细胞中进行测试分析。

通过本研究发现的现象，针对分子伴侣CRT和CNX设计氟中毒疾病的早期预防与治疗方案，可能会为这类疾病的治疗，提供一种新的更为有效的手段。

[1]李广生,徐辉,井玲.内质网应激在氟骨症发生机制中的作用[J].中国地方病学杂志,2010,29(2):225-227.

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