重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80 DNA疫苗体内外表达*

史小玲，李燕，王晓燕，唐利，陈枫，钟森，陈庄

（1.泸州医学院附属医院 医学实验中心，四川 泸州646000；2.成都中医药大学，四川 成都610075）

基因疫苗又称DNA疫苗，是近年来研究的一种新型疫苗，成分清楚，制备简单，可产生强烈而持久的细胞和体液免疫应答，而成为免疫调节剂的较好选择，在疫苗研究中倍受关注[1]。目前，已有4种DNA疫苗产品经许可用于畜禽疾病治疗，并且DNA疫苗正以更加优化的结构、更好的设计应用于人类疾病治疗的临床研究[2]。在之前的实验中，笔者将结核杆菌HSP70基因与人CD80基因拼接，并以pcDNA3.1（+）为载体构建嵌合DNA真核表达质粒[3]。实验结果发现该嵌合DNA质粒，对结核杆菌有很强的抑制作用，并能使IFN-γ 明显增高[4]。在哮喘小鼠实验中发现它能有效减轻炎症细胞浸润，且小鼠肺泡洗脱液中IFN-γ 明显升高[5]。由于pcDNA3.1（+）含有氨卞霉素抗性筛选基因，不能用于人体实验。因此，本实验选用美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐唯一可用于人体实验的质粒pVAX1作为载体重新构建，并观察其在体内外的表达和免疫反应，以期为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

pcDNA3.1-Hsp70/CD80真核表达质粒为本实验室前期构建保存，质粒pVAX1、感受态细胞E.coli DH5α 购于Invitrogen公司，人胚肾细胞293T细胞购于中国科学院细胞库，SPF级雌性健康BALB/c小鼠20只购自第三军医大学[合格证号SCXK（渝）2007-0003]，限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ、T4连接酶购自New England Biolabs，DNA胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，Endofree Plasmid Giga Kit购自Qiagen公司，Lipofectamine LTX and Plus Reagen购于Invitrogen公司，鼠抗结核杆菌Hsp70单克隆抗体购自Lifespan Biosciences公司，鼠抗人CD80单克隆抗体购自Abcam公司，Western blot试剂购自上海碧云天生物公司，总RNA提取试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0购自大连宝生物公司；Sso FastEva Green Supermix购自Bio-Rad公司，BIO-ROD核酸蛋白成像仪，iCycler iQ Real-time PCR扩增仪。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pVAX1-Hs p70/C D80 的构建与鉴定 HindⅢ和XbaⅠ酶切既往构建的质粒pcDNA 3.1-Hsp70/CD80和载体PVAX1，将目的基因Hsp70/CD80定向连接入已酶切pVAX1中，构建质粒pVAX1-Hsp70/CD80，酶切鉴定后由上海生工生物工程有限公司进行测序。将pVAX1-Hsp70/CD80质粒转化入DH5α。用QIAGEN公司去内毒素级质粒大量提取试剂盒，按说明书提取纯化的质粒DNA。

1.2.2 pVAX1-Hs p70/C D80 体外瞬时表达 收集对数生长期的293T细胞，接种于6孔细胞培养板，使细胞汇合度达到50%～80%时，按Lipofectamine LTX and Plus Reagen转染试剂说明书进行转染。分别于转染后24、48和72 h收获细胞，加入裂解液释放蛋白质，离心取上清，与5×上样缓冲液混匀并煮沸使蛋白质变性。SDS-page电泳，转膜。分别加入Hsp70、CD80一抗4℃孵育过夜，洗膜后二抗孵育1 h，加入化学发光试剂置于核酸蛋白成像仪成像。

1.2.3 pVAX1-Hs p70/C D80 体外稳定表达 转染后培养24 h，按1×104个/孔接种于96孔细胞培养板，并进行有限稀释。培养24 h后加入1 000mg G418筛选。筛选10～14 d后，有大量细胞死亡，可见有抗性的克隆出现，以500mg G418维持，扩增培养。获得的稳定转染细胞系命名为293T-HSP70/CD80。Western blot检测Hsp70、CD80蛋白表达。方法同上。

1.2.4 动物实验 近交系BALB/c小鼠20只，饲养于独立通风换气笼具（individually ventilated cages，IVC）中。动物按注射时间分为7 d组、15 d组、30 d组、180 d组，共5组（每组3只）。7 d组、15 d组、30 d组和180 d组小鼠股四头肌分别注射pVAX1-Hsp70/CD80质粒和7.5 g/L布比卡因混悬液（4∶1）125μl，含质粒100μg，注射125μl生理盐水代替。对照组小鼠分别于注射后7、15、30和180 d处死，并取眼球血以及肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织冷冻储存-80℃备用。

1.2.5 R T-PCR 检测Hs p70 和C D80 在小鼠体内的表达 从肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织中提取RNA，按总RNA提取试剂盒说明书进行操作。按TaKaRa RNA PCRKit说明书制备cDNA模板，并进行PCR反应。引物序列：HSP70上游引物CGTCGTCTCGGTTCTGGAAGGTG，下游引物CATTG AAGTAGGCGGGCGTCGTG；CD80上游引物ACACG GAGGCAGGGAACATCACC，下游引物TGGGCGCAG AGCCAGGATCACA。PCR结果行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.6 Real-time PCR 检测小鼠脾脏组织中IFN-γ 和IL-4 表达 从脾脏中提取总RNA，逆转录制备cDNA。进行Real-time PCR反应。引物序列：IFN-γ 上游引物：AACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG，下游引物：GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG；IL-4上游引物：TTTTGAACGAGGTCACAGGAGAGG，下游引物：CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG；β-actin上游引物：AGGGTGTGATGGTGGGAAT，下游引物：CTCGGTGAGCAGCACAGG。反应完成后用Bio-Rad iQ5软件进行分析，按照Pfaffl法计算相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间差异用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80构建与鉴定

经内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切前后的琼脂糖电泳，电泳结果符合预期，表明其建立成功。见图1。送上海生工生物工程有限公司测序后证实该质粒构建成功。

2.2 Western blot检测pVAX1-Hsp70/CD80转染

293T细胞的蛋白质真核瞬时表达和稳定表达结果见图2，转染24、48、72 h后稳定转染293T细胞均有33和72 kD左右的蛋白表达；转染前293T细胞无表达。

2.3 pVAX1-Hsp70/CD80 mRNA体内表达分布

RT-PCR检测接种7和15 d肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织均有Hsp70和CD80表达。接种30 d肌肉、肺和肝有Hsp70表达，未见CD80表达。180 d均未检测出Hsp70/CD80表达，见图3。

2.4 Real time PCR检测IFN-γ 和IL-4基因表达

结果显示，注射pVAX1-Hsp70/CD80质粒7和15 d后IFN-γ 有高水平表达，且高于对照组（P<0.05）。注射pVAX1-Hsp70/CD80质粒180 d后IFNγ 基因表达降低，与对照组比较差异无统计学意义。见图4。

图1 重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80双酶切电泳图

图2 pVAX1-Hsp70/CD80转染293T细胞瞬时表达和稳定表达

图3 Hsp70和CD80在各组织中的表达

图4 注射pVAX1-Hsp70/CD80质粒后7、15、30和180 d IFN-γ 和IL-4基因表达量

3 讨论

分枝杆菌热休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）包含多个T细胞和B细胞表位，可激活效应细胞产生免疫应答，具有免疫优势抗原的特点。还具有结合和呈递抗原肽的作用，能够干扰多种细胞内炎症信号通路，从而抑制炎症反应[6]，调节机体的免疫平衡[7]。CD80（B7-1）表达于活化的B、T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞及外周血单核细胞，具有免疫活化功能，是重要的共刺激分子之一。CD80与其共刺激配体CD28和/或CTLA-4是活化T淋巴细胞时的刺激因子，在体液免疫和细胞免疫中发挥重要的全面活化作用[8]。有研究表明[9]，CD80与其配体CTLA-4结合会对致敏过程中变应原特异性调节性T细胞产生抑制作用。本实验中，将拼接的结核杆菌HSP70和人CD80编码基因定向连接于pVAX1中，经酶切和测序鉴定构建质粒pVAX1-Hsp70/CD80成功。应用阳离子脂质体介导法将重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80转染入293T细胞，经G418筛选后，获得阳性克隆，通过Western blot鉴定，证实Hsp70和CD80在该细胞水平均有表达。

与传统疫苗比较，DNA疫苗具有多方面的优点[10]。但是DNA疫苗的安全性和有效性是在进入临床治疗前必须首先满足的要求。目前，研究大多数偏重于功能性DNA疫苗的构建，而较少考虑到其安全性的问题。本文在上述体外实验基础上，检测pVAX1-Hsp70/CD80接种小鼠后Hsp70和CD80在各组织的表达及小鼠的免疫反应。结果显示接种后7和15 d组肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织均有Hsp70和CD80表达，且脾脏IFN-γ 基因有较高水平表达。说明该质粒能广泛表达Hsp70和CD80，并能诱导IFN-γ 产生较高表达，对机体免疫反应有明显的调节作用。目前，涉及质粒DNA广泛生物分布的机制尚不清楚。据推测，可能是由于载体质粒的运输或转染细胞的运输作用[11]。然而，质粒DNA在体内广泛分布不能只限于一个特定的机制或细胞类型。裸DNA免疫机体后，它可以通过不同的细胞，如细胞CD11b+（2），CD11c（23，24），CD11c和CD19（3）到达远处的脏器[12]。同时，也不能排除质粒DNA通过血液或淋巴系统运输。然而，接种30 d在肌肉、肺和肝有Hsp70表达，未见CD80表达，且脾脏IFN-γ 基因表达明显降低。180 d后未检测出表达，IFN-γ 基因表达几乎降低到对照组水平。说明其表达虽然广泛但有一定时间性，不会长期无限制表达而打乱机体自身免疫平衡，这为疫苗在后续实验研究中奠定了理论基础，也为该疫苗在临床应用提供了可能。

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