133例乙型肝炎病毒X基因测序结果分析

高 慧，何金花，崔美玲，陈伟明，潘莲娣

（广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

133例乙型肝炎病毒X基因测序结果分析

高 慧，何金花，崔美玲，陈伟明，潘莲娣

（广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

目的 对乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清标本的HBV X基因进行测序，以了解其突变情况。方法从广州市番禺区133例HBV感染者的血清标本中提取HBV DNA，以PCR方法扩增HBV X基因，再进行测序，根据患者不同病程将其分为乙肝携带组(ASC组)36例、慢性肝炎组(CHB组)40例、肝硬化组(LC组)34例和肝癌组(HCC组)23例，并对结果进行综合比较分析。结果人均碱基突变数ASC组为(5.17±0.86)、CHB组为(5.05±0.80)、LC组为(3.43±0.59)，HCC组为(2.05±0.44)，ASC组、CHB组和LC组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，而HCC组均低于ASC组、CHB组、LC组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；HBV X基因突变检出率排前4位的位点是：A1762T联合G1764A双变异为85例(63.91%)，T1719G联合G1721A同时变异为77例(57.89%)，T1544A为62例(46.62%)，T1753C为45例(33.83%)。前4位突变检出率均在LC组中最高(P＜0.05)。结论对HBV X基因的高突变位点进行检测为肝硬化及肝癌的发病机制提供线索，对尽早预防和预测肝硬化及肝癌具有重要意义。

肝炎病毒；乙型；测序；X基因；基因型；变异；肝硬化；肝癌

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒(HBV)，我国是乙肝感染的大国，发病率高，感染力强，各个年龄组均有乙肝病例发生，严重者可致肝癌[1-2]。HBV为双链环形DNA病毒，双链分别称为正链、负链。负链有4个开放区，其中最小的开放读码框为X基因[3]，其变异可能具有重要生物学意义。最近许多国家地区都独自进行了HBV的基因突变与相应地区肝癌(HCC)的相关性研究，结果显示，突变的类型以及相关性，不同地区不尽一致[4-6]。广州市番禺区尚未报道此具体情况，本文对仅来自广州市番禺区的133例乙肝患者的血清标本进行基因测序，现将测序结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年6月至2013年6月本院传染科门诊及住院HBV DNA阳性患者133例，其中男性108例，女性25例，年龄19～78岁，均出生于广州市番禺区，并在本区生活至今，将患者分为乙肝携带组(ASC组)36例，平均年龄(37±10.93)岁；慢性肝炎组(CHB组)40例，平均年龄(40±16.48)岁；肝硬化组(LC组)34例，平均年龄(52±10.16)岁；肝癌组(HCC组)23例，平均年龄(58±10.74)岁。四组患者的年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。诊断标准参照《病毒性肝炎防治方案》[4]，肝癌的诊断标准符合2001年修订的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[7]，血清收集后于-70℃冻存至检测。

1.2 HBV基因型序列 自美国国立生物技术信息中心基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下载B及C基因型各1个。

1.3 方法 血清HBV DNA提取采用经典酚-氯仿抽提法，HBV X基因扩增：上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3'，下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3'，PCR反应体系为ddH2O 15.3µl、10×Bufffer 2.0µl、Template 1.0µl、Primer F 0.5µl、Primer R 0.5µl、dNTP 0.5µl、TransStartTaq Polymerase 0.2µl、Volume 20µl；PCR循环参数为预变性95℃5 min；95℃45 s、60℃45 s、72℃30 s，共9个循环；95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s，共34个循环；延伸72℃5 min。PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序部进行测序，测序结果与2个标准B及C基因型序列均不同的碱基即为突变碱基。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学处理，人均碱基突变数两两比较采用t检验，多组比较采用方差分析，HBV X基因突变检出率采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人均碱基突变数比较 人均碱基突变数ASC组为(5.17±0.86)、CHB组为(5.05±0.80)、LC组为(3.43±0.59)、HCC组为(2.05±0.44)，ASC组、CHB组、LC组之间比较差异均无统计学意义(ASC与CHB：t= 1.176，P=0.996＞0.05；ASC与LC：t=1.044，P=1.000＞0.05；CHB与LC：t=0.992，P=0.999＞0.05)，HCC组均低于ASC组、CHB组和LC组(F=0.966，P=0.043＜0.05；F=0.910，P=0.003＜0.05；F=0.732，P=0.001＜0.05)。

2.2 突变点检出率情况 133例患者HBV X基因共有29种突变，前4位突变检出率的位点是A1762T联合G1764A双变异为85例(63.91%)，检出率在LC组中最高(χ2=28.165，P=0.000＜0.05)；T1719G联合G1721A同时变异为77例(57.89%)，检出率在LC组中最高(χ2=7.853，P=0.049＜0.05)；1544A为62例(46.62%)，检出率在LC组中最高(χ2=53.764，P= 0.000＜0.05)；T1753C为45例(33.83%)检出率在LC组中最高(χ2=12.728，P=0.005＜0.05)，见表1。

表1 HBV X基因区突变的分布情况

注:核苷酸类G为鸟嘌呤；A为腺嘌呤；C为胞嘧啶；T为胸腺嘧啶。氨基酸类F为苯丙氨酸；L为亮氨酸；S为丝氨酸；Y为酪氨酸；C为半胱氨酸；P为脯氨酸；H为组氨酸；Q为谷氨酰胺；R为精氨酸；I为异亮氨酸；M为蛋氨酸；T为苏氨酸；N为天冬酰胺；K为赖氨酸；S为丝氨酸；R为精氨酸；V为缬氨酸；A为丙氨酸；D为天冬氨酸；E为谷氨酸；G为甘氨酸。

3 讨论

近年来国内不断有关于HBV X基因的突变情况以及突变与HCC的联系的报道，大致如下：BCP(基本启动子nt1742-1849)的突变研究主要集中在第二个AT富含区的突变热点区，尤以A1762T及G1764A的联合点突变为常见，称为双突变，可以减少HBeAg的表达，增强病毒的复制，在HCC患者中经常会发现这种变异；CP(启动子nt1643-1849)聚集变异导致HBV DNA转录有明显激活作用的肝细胞核因子的结合位点的出现，对病毒的转录和复制具有明显增强作用[5-8]。

在本组资料中，LC组中人均碱基突变数最高，HCC组最低，与文献[9]报道HCC组突变率最高不同，其中一个原因可能是不同地区的人群遗传背景不尽一致，HBV的基因突变也不尽相同，另一个原因可能是乙肝患者病情的进展与HBV X碱基突变数量无关，而是与突变位置有关。

据报道，在HBV X基因的不同型别中，我国以B、C基因型为主[10-11]，本研究测序的结果与标准B基因型和C基因型对比，与两者均不相同的碱基即为突变碱基。本组资料中，点突变率发生最高的是A1762T联合G1764A双变异，其中LC组中最高97.06%，其次是HCC组73.91%。已有很多报道[9-12]揭示该双变异在肝硬化和肝癌发生中起促进作用，本研究与该文献基本吻合，但本研究中，但该双变异在ASC组及CHB组中也不低，分别为50.0%及42.5%，该结果提示在广州市番禺区，A1762T/G1764A双突变除了在LC组及HCC组中有非常高的突变率，在ASC及CHB组中的突变也不低，这类人群是否最终发展为LC或HCC，还待进一步跟踪观察。这类人群，尤其是ASC患者，常常因临床症状不明显，而忽视对病情的监测及估计，建议本区的肝炎患者在条件许可下对该双突变位点进行检测，以评估病情恶变的风险。此外，在ASC组中有1例及HCC组中有2例A1762T单变异，在CHB组及HCC组各有1例G1764A单变异，这种单变异的临床意义尚不明确，有待进一步研究。

另一个热点突变T1719G，此单突变在ASC组中检出率(41.67%)最高，HCC组(8.7%)中最低(P＜0.05)，与文献[9]吻合，该文献报道T1719G突变能降低HBV的致病性和致癌作用，但是值得注意的是，T1719G联合G1721A同时突变，LC组中则由T1719G单突变的11.76%上升至 T1719G联合G1721A双突变的76.47%，突变率最高，HCC组由8.7%上升至52.17%。G1721A单突变例数较少，只在CHB组有1例，LC组有3例，因其单突变并未导致氨基酸的种类改变(L116L)，应该没有临床意义，T1719G单突变致病作用不大，但其联合G1721A双突变的致病性则大大增加，尤其是对肝硬化有促进作用。这也说明，肝炎患者病情的进展可能与碱基突变位置及其组合突变有关。

在本组资料中T1544A点突变在ASC组及CHB组的突变率30.56%及32.50%，LC组全部突变，突变率为100%，在HCC组则降到17.30%，提示，该点突变与肝癌的发生关系不大，与肝硬化的发生明显相关，至于该点突变是否可作为肝硬化的特异性突变位点之一，还为言尚早，因为本研究LC组的人数为34例，还需进一步扩大样本量才作结论。

本组资料中A1775G点突变，检出率由ASC组、CHB组的36.11%及37.50%，上升至LC组的100%、HCC组的73.91%，因该点突变并未导致其所翻译的氨基酸的改变(L134L)，可能单突变时无临床意义，但不排除其联合其他点突变时，则加大病程的进展。

综上所述，133例HBV患者血清HBV X基因突变复杂多样，前4位有义突变点检出率及人均突变点数均在肝硬化组中最高。这一结果显示，在本地区这些热点突变很可能促进了肝炎向肝硬化方向的发展，对这些突变位点进行检测，可了解疾病的发展及预后，并为临床治疗提供参考。对于肝炎患者，包括HBV携带者，均应长期观察，定期复查，检出并控制无症状的肝炎，从而获得及时处理，延缓疾病的进展。

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Sequencing analysis of hepatitis B virus X genes from 133 cases of patients.

GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling, CHEN Wei-ming,PAN Lian-di.Department of Clinical Laboratory,Panyu Center Hospital,Guangzhou 511400, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo understand the mutation of hepatitis B virus X gene by gene sequencing from HBV infected serum.MethodsHBV DNAs were extracted from the serum of 133 infectors from Panyu area,and HBV X genes were amplified by PCR and then sequenced.According to the different courses of disease,patients were divided into four groups:36 cases of hepatitis B virus carrier(ASC),40 cases of chronic hepatitis(CHB),34 cases of liver cirrhosis(LC)and 23 cases of hepatocellular carcinoma(HCC).And the results were comprehensively and comparatively analyzed.ResultsThe mutation numbers per capita of four groups were as follows:ASC group(5.17±0.86), CHB group(5.05±0.80),LC group(3.43±0.86)and HCC group(2.05±0.44).And there were no statistically significant difference between the ASC group,CHB group and LC group(P＞0.05),while the number in HCC group was lower than that in the other three groups(P＜0.05).The top 4 sites of HBV X gene mutation detection rates were:85 cases of A1762T/G1764A double mutation(63.91%),77 cases of T1719G/G1721A simultaneous mutation(57.89%),62 cases of T1544A(46.62%)and 45 cases of T1753C(33.83%).The top 4 sites of mutation detection rates were all highest in LC group(P＜0.05).ConclusionDetection of the high mutation site of HBV X gene could help provide clues for studying the mechanism of liver cirrhosis and liver cancer,which also presents significant reference for clinical practice.

Hepatitis virus;Hepatitis B;Sequencing;X gene;Genotype;Variation;Liver cirrhosis;Hepatocarcinoma

R512.6+2

A

1003—6350（2015）07—1001—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0357

2014-09-30)

广州市番禺区科技计划项目（编号：2012-Z-03-17）

高 慧。E-mail：gaohui5555@126.com