人CD63真核表达质粒的构建及在TCA8113细胞中的表达与定位

刘文慧，阚丽丽，侯美玲，梁雪雪，赵 微，李 新

1辽宁医学院，辽宁锦州 121200；2盘锦市辽河油田总医院，辽宁盘锦 124000；3辽宁医学院附属第二医院，辽宁锦州 121200

我国口腔癌中舌癌的发病率居第一位[1]。近年来，舌癌发病趋于年轻化，严重威胁人民健康[2-3]。研究舌癌发生发展的分子生物学机制及探寻积极有效的治疗方法显得十分迫切和必要。CD63是最具表征的的四次跨膜蛋白，参与细胞的活化、黏附、变异与肿瘤的侵袭、转移等多种生命过程。文献报道CD63的表达量与多种肿瘤的侵袭、转移存在负相关，如恶性黑色素瘤、卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌和结肠癌等，CD63的消减沉默促进了肿瘤的侵袭与转移[4]。Lupia等[5]的研究结果揭示了CD63在抑制黑色素瘤上皮-间质转换过程中的重要作用，为探寻黑色素瘤发生、发展的机制提供了新的线索。Toricelli等[6]研究表明，CD63、基质金属蛋白酶抑制剂1及整合素β1通过激活独立于Akt磷酸化的PI3-K信号通路在黑色素瘤的起源、失巢凋亡抵抗过程中相互作用。Kang等[7]研究指出，在TM4SF5与CD151相互作用下，细胞表面的CD63内化并转运到晚期溶酶体，可能导致CD63抑瘤作用的终止，进而影响肝癌的转移。目前，CD63与舌癌侵袭、转移相关性的研究尚未见报道，鉴于CD63表达量与多种肿瘤侵袭、转移密切的相关性，本研究通过构建人CD63真核表达质粒，观察其在人舌鳞癌细胞TCA8113中的表达与定位，为进一步研究CD63与舌癌侵袭、转移的相关性奠定基础。

材料和方法

1 实验材料 pcDNA3.1(+)质粒、TCA8113细胞株由本实验室保存，CD63鼠IgG、β-actin鼠IgG、HRP标记二抗、FITC标记二抗均购自北京中衫金桥公司；E.coli DH5α购自天根生物；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、PCR试剂、限制性核酸内切酶HindⅢ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DL1000 DNA marker、170 kU protein marker均购自大连宝生物公司。

2 引物设计与合成 利用Primer 5.0软件设计扩增CD63基因的特异性引物，在上游引物的5'端设计HindⅢ酶切位点，下游引物的5'端设计了XhoⅠ酶切位点，上游引物序列：5'-CCCAAGCTT GCCACCATGGCGGTGGAAGGAGGAATGAAATG-3'，下游引物：5'-CCGCTCGAGCATCACCTCGTAGCCA CTTCTGATAC-3'，引物由上海生工合成。

3 CD63基因的扩增和重组真核表达质粒的构建提取舌癌细胞TCA8113总RNA，参照Takara逆转录试剂盒说明配置反转录体系，反转录反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到cDNA，以此为模板PCR扩增CD63基因，扩增体系为50μl：无菌水35μl；cDNA 2μl；上下游引物各1μl；rTaq酶1μl；dNTPs 5μl；10×PCR buffer 5μl。扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环后，再于72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段纯化回收。纯化后的CD63基因片段与真核表达质粒pcDNA3.1(+)分别进行双酶切反应。反应体系50μl：无菌水31μl；10×buffer 5μl；质粒/DNA片段10μl；HindⅢ、XhoⅠ各2μl，37℃反应4 h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收后，T4连接酶16℃连接过夜。连接体系15μl：无菌水1.5μl；10×T4连接酶buffer 1.5μl；T4连接酶1μl；质粒1μl；DNA片段10μl。将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂于AMP+的固体LB琼脂培养板上，次日挑取阳性克隆37℃扩大培养后抽提质粒，经HindⅢ、XhoⅠ双酶切鉴定正确后，行DNA序列测定，测序由上海生工完成，测序正确后，得到构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3.1-CD63。

4 pcDNA3.1-CD63蛋白的表达及Westerrn blot检测 接种TCA8113细胞，次日细胞融合90%时，用 Lipofectamine 2000转 染 pcDNA3.1-CD63及pcDNA3.1(+)质粒，6 h后更换培养基，48 h后用细胞刮器收集细胞，RIPA + 1% PMSF裂解细胞，BCA蛋白定量后制样行Western blot检测CD63表达情况。一抗为CD63单克隆鼠IgG(1∶500稀释)，β-actin单克隆鼠IgG(1∶1 000稀释)，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释)。

5 pcDNA3.1-CD63蛋 白 及 内 源 性CD63在TCA8113细胞内定位 接种TCA8113细胞于六孔板中制备细胞爬片，使次日转染时细胞融合约90%，用Lipofectamine 2000转染pcDNA3.1-CD63质粒，6 h后换为完全培养基。48 h后弃液，PBS洗2遍。将正常细胞和转染后细胞爬片用4℃预冷的4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗3遍，0.1% Triton室温打孔10 min，PBS洗3遍，1% BSA室温封闭1 h，加入CD63单克隆抗体(鼠，1∶500稀释)，37℃孵育1.5 h，PBS洗3遍，加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗(1∶1 000稀释)，37℃孵育1.5 h，PBS洗3遍后，将爬片取出置于载玻片上，甘油封片，扫描共聚焦显微镜观察。

结 果

1 CD63基因PCR扩增 PCR扩增的CD63基因片段经1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，CD63基因在717 bp处有特异性条带，条带大小与预期相符。

2 pcDNA3.1-CD63质粒酶切鉴定及测序 挑取阳性克隆扩大培养，提取质粒进行HindⅢ、XhoⅠ双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测可见717 bp和5 428 bp两条带，其大小均符合目的片段大小(图2)。将菌液送上海生工测序，测序结果正确无误，得到成功构建的pcDNA3.1-CD63质粒。

3 Western blot检测pcDNA3.1-CD63在TCA8113中的表达 将正常TCA8113细胞，分别转染pcDNA3.1-CD63空载体和pcDNA3.1-CD63 48 h的细胞分别收样，裂解后BCA蛋白定量，Western blot检测可见转染pcDNA3.1-CD63的TCA8113细胞CD63表达量高于对照组。如图3。

4 pcDNA3.1-CD63蛋白与内源CD63的表达与定位 pcDNA3.1-CD63转染TCA8113细胞后48 h行间接免疫荧光检测，共聚焦显微镜观察可见转染pcDNA3.1-CD63的TCA8113细胞有明亮绿色荧光表达，荧光主要集中于细胞膜，与内源性CD63蛋白表达定位相似，可见pcDNA3.1-CD63能在TCA8113细胞中高效表达。如图4。

图1 CD63基因的PCR扩增 M： DL1000 DNA Marker; Lane 1：CD63 Gene图 2 重组质粒双酶切鉴定M: DL1000 DNA marker; Lane 1：recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63 digested by HindⅢand XhoⅠFig. 1 PCR results of CD63 gene M： DL1000 DNA Marker; Lane 1： CD63 GeneFig. 2 Identif cation of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion M: DL1000 DNA marker; Lane 1：recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63 digested by HindⅢand XhoⅠ

图3 蛋白免疫印迹检测pcDNA3.1-CD63蛋白的表达

图4 免疫荧光检测pcDNA3.1-CD63蛋白在TCA8113中的的表达与定位A：TCA8113 cells control；B：TCA8113 cell transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63；scale bar:25μmFig. 4 Expression and location of pcDNA3.1-CD63 in TCA8113 cells detected by immunof uorescenceA：TCA8113 cells control；B：TCA8113 cell transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-CD63；scale bar:25μm

讨 论

舌癌生长快，恶性程度高，浸润性较强，极易发生局部侵袭及通过淋巴、血液循环引起全身转移，总体5年生存率仅50% ～ 60%，是导致患者死亡的主要因素[8]。虽然以手术为主、放化疗为辅的综合序列治疗方案取得较好疗效，然而舌癌术后生存率未见显著提高，且手术治疗舌癌存在着诸多不良后果。目前国内外对舌癌的研究多集中在其侵袭与转移的分子机制。从分子水平进一步探讨影响舌鳞癌发生、发展及预后的因素，对于提高舌癌的疗效具有重大意义。

在1988年Hotta等[9]发现CD63丰富表达于早期黑色素瘤，随着肿瘤的恶变，CD63的表达量逐渐下降，而肿瘤细胞变得更具侵袭性。Jang和Lee[10]用RNAi技术使CD63沉默后发现，黑色素瘤细胞的变形能力及基质降解能力大大增强。而在CD63基因敲除的黑色素瘤细胞，当转染外源CD63后，细胞的变形和迁移能力降低并且更易于黏附于胞外基质，此过程中有整合素的参与[11]。随后CD63表达量与肿瘤恶变的相关性也相继见于其他肿瘤如卵巢癌[12]、肺腺癌[13]、乳腺癌[14]和结肠癌[15]等。整合素介导了肿瘤细胞与细胞外基质的黏附过程，而CD63通过与整合素α4β1，α3β1等之间的相互作用影响了肿瘤细胞的变形和迁移能力[16-20]。同时有研究指出，CD63还参与调节其他影响肿瘤进展蛋白的转运过程，如通过参与胞外基质的翻转进而增强肿瘤侵袭、转移能力的膜相关型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)。在CD63过表达的人胚胎肾细胞，MT1-MMP通过和CD63 N端结合，开启其内吞及靶向输送到溶酶体降解的过程，进而导致MT1-MMP水平降低[21]。除了和肿瘤密切相关，CD63还具有其他重要生物学功能，如参与调节HIV-1的感染和复制[22]；作为慢性荨麻疹的分子学标志物介导过敏反应[23]；CD63能使活化的B细胞中CRCX4表达下调，进而影响T细胞免疫[24]；TIMP-1通过CD63和整合素的信号传导调节人神经干细胞的趋化性[25]；CD63能促使整合素β1-VEGFR2复合体的形成，调节下游信号转导，进而影响白细胞的募集，黏附过程[26]等。目前，CD63与舌癌侵袭、转移的相关性国内外未见报道，鉴于CD63与许多肿瘤的侵袭与转移密切相关，我们推测，CD63在舌癌的侵袭与转移中也起到类似重要作用。为此，本研究根据CD63的基因序列，设计了一对CD63基因特异性引物，通过提取TCA8113细胞总RNA，RT-PCR法获得CD63基因片段，通过酶切鉴定及DNA测序，成功构建pcDNA3.1-CD63真核表达质粒。Western blot验证了pcDNA3.1-CD63蛋白在TCA8113细胞中的高效表达，免疫荧光显示其定位与内源性CD63蛋白定位相似，均表达于细胞膜。

本研究构建的pcDNA3.1-CD63真核表达质粒可用于研究CD63蛋白对舌癌细胞生物学行为的影响，为进一步探讨CD63表达量和舌癌细胞侵袭、转移能力之间的相关性奠定基础。后续我们开展了正常TCA8113细胞和高表达CD63细胞的划痕实验以及Transwell细胞迁移实验，实验结果显示，高表达CD63的TCA8113细胞划痕后24 h迁移距离明显小于正常细胞，且高表达CD63的TCA8113细胞接种24 h穿过膜的数量明显少于正常细胞，经统计学分析，差异有统计学意义。

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