纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞整合素α4β1表达的影响

胡艳吴瑜瑜

作者单位: 362000福州市，福建医科大学附属第二临床医学院(胡艳现工作单位为长沙爱尔眼科医院)

纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞整合素α4β1表达的影响

胡艳吴瑜瑜

作者单位: 362000福州市，福建医科大学附属第二临床医学院(胡艳现工作单位为长沙爱尔眼科医院)

【摘要】目的探讨纤维连接蛋白(FN)对体外培养的原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞整合素α4β1表达及细胞存活的影响。方法对照实验研究，体外培养POAG患者小梁网细胞，分别加入不同浓度的FN培养。采用免疫细胞化学法观察各组细胞整合素α4β1的表达及细胞存活情况。结果随着FN浓度增加，整合素α4β1表达增强;在FN低浓度范围内阳性细胞面积增多。结论FN影响小梁网细胞肌动蛋白骨架及其细胞连接，改变来参与房水流出的调节过程。

【关键词】小梁网细胞;原发性开角型青光眼;纤维连接蛋白;整合素α4β1;免疫细胞化学法

项目来源:福建省教育厅科技项目(编号: JA07107) ;泉州市技术研究与开发项目(编号: 2007Z18)

E-mail: wuyy62@ tom.com

纤维连接蛋白(FN)在原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞中高表达，提示FN对POAG的发生可能起重要作用［1］。小梁网细胞骨架对调节房水流出起一定作用，其主要成分肌动蛋白是通过改变小梁网细胞收缩特性，削减小梁网细胞之间、细胞与基质之间的连接［2］，本研究采用免疫细胞化学方法检测FN对POAG病态小梁网细胞整合素α4β1分泌的调节及细胞存活的影响，探讨其与POAG发病机制的关系。

1　材料与方法

1.1标本来源与处理体外细胞培养组织块来自福建医科大学第二临床医学院眼科2008年9月至2009 年6月确诊的3例POAG患者，对小梁切除术后取得的带小梁网组织块进行细胞培养，符合人体细胞实验的伦理学标准。患者年龄分别为45、48、51岁，无高血压、糖尿病、传染性和遗传性疾病史。

1.2主要试剂及方法UltraSensitive TMSP超敏试剂盒，DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。纤维连接蛋白购自CHMICON公司，整合素α4β1抗体购自ABCAM公司。在6孔培养板上铺盖玻片，用不同浓度的FN(0、5、10、20、40、100 μg/ml)包被，将小梁网细胞接种于6孔板，每组2个复孔，调整细胞浓度为2.5×104个/ml。无血清培养液培养1 d后，使细胞同步化，取出盖玻片，PBS充分漂洗。然后按照Ultra SensitiveTM SP超敏试剂盒实验步骤操作，直至二氨基联苯胺显色。

1.3结果判断镜下观察整合素α4β1的表达，以出现棕色染色为阳性标准，实验重复3次。封片后每张切片随机取10个视野输入计算机，采用MetaMorph免疫组化显微图象分析系统在200倍视野范围随机选取10个视野计算平均吸光度值。

1.4统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，进行one-way ANOVA检验，两两比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1FN对POAG患者小梁网细胞整合素α4β1表达的影响随着FN浓度增加，整合素α4β1表达增强。在5 μg/ml纤维连接蛋白培养的小梁网细胞细胞核染色为蓝色，细胞胞浆为蓝色可见淡棕色颗粒，表达很少，在10 μg/ml纤维连接蛋白培养的小梁网细胞胞浆棕色加深，随着纤维连接蛋白的浓度的增加，细胞核始终为蓝色，细胞胞浆为棕色逐渐加深。见表1，图1。

2.2FN对POAG患者小梁网细胞存活的影响随着FN浓度增加，在FN低浓度范围内(0～100 μg/ml)阳性细胞面积增多。见表2。

3　讨论

整合素由不同α与β亚基组成，α亚基与配体识别有关，β亚基将信号传导至细胞骨架，是许多细胞增生和迁移的基础［3］。FN是小梁网组织的细胞外基质主要成分，广泛存在于Schlemm管内壁的基底膜和小梁网近管组织，并且是房水的一种可溶性蛋白，是细胞外基质重要组成部分。小梁网细胞的黏附及肌动蛋白的收缩主要由FN上两个特殊的区域调节: CellⅠ结合域和HepⅡ结合域［4］。HepⅡ结合域主要与整合素

表1　FN对POAG患者小梁网细胞整合素α4β1表达的影响　±s

表1　FN对POAG患者小梁网细胞整合素α4β1表达的影响　±s

注:与0比较，*P＜0.05;与5比较，#P＜0.05;与10比较，△P＜0.05;与20比较，☆P＜0.05;与40比较，▲P＜0.05

FN(μg/ml)0510　20　40　100 OD　0.231±0.001　0.232±0.005*　0.245±0.003* #　0.263±0.005* #△　0.276±0.004* #△☆　0.385±0.019* #△▲

表2　FN对POAG患者小梁网细胞整合素α4β1阳性面积表达的影响　±s

表2　FN对POAG患者小梁网细胞整合素α4β1阳性面积表达的影响　±s

注:与0比较，*P＜0.05;与5比较，#P＜0.05;与10比较，△P＜0.05;与20比较，☆P＜0.05;与40比较，▲P＜0.05

FN(μg/ml)0510　20　40　100 OD　0.1202±0.012　0.1218±0.013*　0.1346±0.016* #　0.1419±0.012* #△　0.1679±0.011* #△☆　0.21993±0.019* #△▲

图1　不同浓度的FN处理后的POAG患者小梁网细胞(SP×200)

α4β1结合促进黏着斑和张力丝的形成，利用肌动蛋白骨架的改变调节眼内压。

本研究中小梁网细胞在无血清培养基培养24 h，使细胞同步化后，尽量排除血清中其他生长因子对细胞生物学特性的干扰。每张标本分别取同一光照强度，10个随机视野，最大程度的减小误差，从而增加实验结果的可信度。结果表明，FN浓度为0～100 μg/ml内随着浓度的增加，整合素α4β1表达增加，与包被浓度呈正相关; FN浓度为0～100 μg/ml内随浓度的增加，细胞存活增加。原因可能为纤维连接蛋白与整合素α4β1结合，两者相互协同信号可促进小梁网中的肌动蛋白交联网状结构形成:刺激张力丝形成和黏附斑激酶磷酸化，肌动蛋白和微丝蛋白重组，均使细胞骨架发生改变［3］。细胞骨架含量、成分以及质量异常均可使小梁网细胞的形态发生改变，影响小梁网的收缩和伸展，最终影响房水循环通路［5］。

张力丝是细胞内长而直的网状结构，常与细胞的长轴大致平行并贯穿于细胞的全长，由大量的微丝束组成，点黏附复合体的黏附作用是通过张力丝、纤维连接蛋白和整合素a4β1来实现细胞与细胞外基质之间的连接作用，纽蛋白是点黏附复合体主要的黏附蛋白，一端通过其他黏附分子与细胞质膜连接，另一端与微丝束它还和细胞与细胞底物的附着和细胞与细胞之间的连接功能有关［6］。点复合黏附体内的纽蛋白将肌动蛋白锚于细胞膜上，对微丝束的固定起着稳定作用，张力纤维活动减小，细胞间隙增大，房水外流阻力减少。整合素a4β1与纤维连接蛋白结合信号刺激黏附斑激酶磷酸化，黏附斑的收缩性增强，可使其周围小梁网间隙增大，房水外流阻力减少，还能调节小梁网细胞的黏附强度和收缩力［7］。

FN能调节眼内压，并且处于一个动态平衡过程。纤维连接蛋白与整合素α4β1结合，在一定浓度范围上调整合素α4β1，刺激黏着斑和张力丝的形成，利用肌动蛋白骨架的改变来调节眼内压。但目前FN在小梁网细胞的效能以及如何调节房水外流阻力来改变眼内压的作用机制尚未完全清楚，需要进一步研究。

参考文献

1李高坚.青光眼的临床研究进展与发展趋势.当代医学，2012，10: 13-14

2张娴，袁援生.原发性开角型青光眼基因基础研究.当代医学，2011，8: 37-38.

3Filla MS，Schwinn MK，Sheibani N，et al.Regulation of cross-linked actin network(CLAN) formation in human trabecular meshwork(HTM) cells by convergence of distinct beta1 and beta3 integrin pathways.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50: 5723-5731.

4Faralli JA，Schwinn MK，Gonzalez JM Jr，et al.Functional properties of fibronectin in the trabecular meshwork.Exp Eye Res，2009，88: 689-693.

5Peterson JA，Peters DM.Heparin II (HepII) domain of fibronectin modulates rho mediated events in proliferating human trabecular meshwork (HTM) cells via α41 Integrin.Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45: EAbstract 4369.

6Schwinn MK，Gonzalez JM Jr，Gabelt BT，et al.Heparin II domain of fibronectin mediates contractility through an alpha4beta1 co-signaling pathway.Exp Cell Res，2010，316: 1500-1512.

7Faralli JA，Peters JM，Newman JR，et al.Effect of heparin II domain of fibronectin on actin cytoskeleton and adherens junctions in human trabecular meshwork cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47: 2924-2931.

(收稿日期:2014－08－19)

通讯作者:吴瑜瑜，362000福州市，福建医科大学附属第二临床医学院;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.07.034

【文章编号】1002－7386(2015) 07－1060－02

【文献标识码】A

【中图分类号】R 775.2