灵芝孢子油抑制前列腺癌LNCaP细胞中AR激活及转录活性*

张豫明 班素芬 余双霞 曾方银

灵芝孢子油是从灵芝孢子中提取出的具有生物活性的油状脂质物，含有诸如多糖、三萜类、脂肪酸及微生物等。已有研究证实，灵芝孢子具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等作用[1-4]。近期研究进一步显示，灵芝孢子油不仅具有抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡，而且还抑制肿瘤的迁移和血管生成[5-11]。前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，近年来随着生活水平的提高和人的预期寿命不断延长，前列腺癌的发病率呈显著上升趋势。其中，雄激素受体在前列腺癌的发生发展中占有重要地位[12-14]。本研究探讨灵芝孢子油对双氰睾酮（Diydrotestoserone，DHT）诱导的前列腺癌LNCaP增殖、雄激素受体AR的激活和转录活性及相关激酶的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基和胎牛血清（Hyclone），PKD1（A-20） 和 AR抗体（Santa Cruz），PKD磷酸化抗体（s744/748）和AR磷酸化抗体（pAR）购自CST；Beta-actin 抗 体（C4）：SC-47778（Santa Cruz），Lipofectamine2000（LIFE公司），双氢睾酮（DHT）（Sigma公司），聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS、Tris及甘氨酸等超纯生化试剂等（Promega公司）。人类雄激素受体结合的荧光素酶报告质粒pMMTV-luc（鹿特丹大学医学中心Dr.Brinkmann惠赠），海肾荧光素酶报告内参照质粒pRL-SV40（Promega公司），双色荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual luciferase reporter assay试剂盒）购自Promega公司。

1.2 细胞株和细胞培养 LNCaP细胞（购自上海细胞库）培养于DMEM完全培养基（10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ng/mL链霉素）中，培养条件为37 ℃，5% CO2。

1.3 细胞增殖检测 采用CCK-8法检测细胞增殖活性。简述如下：LNCaP细胞消化铺至96孔板中，100 μL/孔，细胞数量为1000/孔。将培养板在37 ℃、5% CO2培养箱预培养过夜，每孔1∶100加入CCK-8溶液，放置培养箱内孵育2~4 h后Bio-Rad model 680 microplate reader酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD），按如下公式计算细胞活性：细胞增殖活力/%=（处理组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。

1.4 实验处理及质粒转染 将LNCaP细胞分三组，即Control组、DHT处理组、DHT和灵芝孢子油共同处理组（DHT+Oil）。将对数期生长的LNCaP细胞按合适的密度和上述分组分别接种于24孔板或6孔板中，过夜后：（1）按上述处理组分别加入Control组（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20 μg/mL），24 h后CCK-8检测细胞增殖活性，Western blot检测蛋白表达；（2）分别荧光素酶报告质粒pMMTV-luc及海肾荧光素酶报告质粒pRL-SV40转染上述三组细胞，12 h后分别加入Control组（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20μg/mL）处理24 h，收集细胞裂解液进行双萤光素酶报告基因活性检测。

1.5 Western blot 收集细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清Bradford法测定蛋白浓度。取等量的蛋白进行SDSPAGE电泳并转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入多克隆抗体，4 ℃过夜。将膜移至HRP标记的二抗（1∶2000）中，室温孵育1 h。膜置于化学发光液中，曝光、显影及定影。

1.6 荧光素酶报告质粒pMMTV-AR转录活性检测 参照Promega的Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统的说明书分别测定荧光素酶报告质粒pMMTV-luc和海肾荧光素酶报告质粒pRL-SV40的荧光素酶活性，以两者的相对比值作为荧光素酶相对活性单位（Relative luciferase unit，RLU）。

1.7 统计学处理 条图的制作和统计均使用Graphpad Prism 5.0软件，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灵芝孢子油降低DHT诱导的LNCaP细胞的增殖和存活 为了探讨灵芝孢子油对雄激素依赖的前列腺癌LNCaP细胞生长的抑制作用，笔者检测了DHT刺激作用下，有无灵芝孢子油处理对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响，结果如图1所示，CCK-8检测肿瘤细胞增殖活性表明，二氢睾酮（DHT，10 nM）刺激作用下明显增加LNCaP细胞的增殖活性，而灵芝孢子油处理（20 μg/mL）则明显降低DHT刺激的LNCaP细胞的增殖活性，与DHT组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。

图1 灵芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP细胞的增殖活性*与DHT组比较，P<0.01

2.2 灵芝孢子油降低DHT诱导的 LNCaP细胞中AR的磷酸化激活 雄激素受体（Androgen receptor，AR）的激活是DHT诱导的LNCaP细胞增殖及下游靶基因表达的关键。为了明确灵芝孢子油是否抑制DHT诱导的AR的磷酸化激活，笔者同样检测了DHT刺激作用下，有无灵芝孢子油处理对前列腺癌LNCaP细胞AR的表达及磷酸化活性的影响，结果表明：DHT刺激明显增加雄激素受体（AR）的磷酸化活性，而同时灵芝孢子油处理则明显降低DHT诱导的AR磷酸化激活，而对AR的表达水平无影响，提示灵芝孢子油可能是通过抑制AR的磷酸化而抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖，见图2。

2.3 灵芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP细胞中蛋白激酶D的磷酸化激活 为了探讨灵芝孢子油是否抑制DHT诱导的前列腺癌细胞中蛋白激酶D（Protein kinase D，PKD）的磷酸化活性，笔者也检测了有无灵芝孢子油处理作用下对PKD磷酸化活性的影响，与AR作用相似，DHT刺激明显增加PKD（ser744/748）的磷酸化活性，而灵芝孢子油处理则明显降低DHT诱导PKD（ser744/748）的磷酸化活性，对PKD的蛋白表达水平无影响，见图3。

图2 灵芝孢子油降低DHT诱导的雄激素受体（AR）

图3 灵芝孢子油降低DHT诱导的PKD（ser744/748）的磷酸化活性

2.4 灵芝孢子油抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录活性 由于灵芝孢子油明显降低前列腺癌LNCaP细胞中DHT诱导的AR磷酸化激活，而对AR的表达水平无影响，进而笔者利用荧光素酶报告基因检测了灵芝孢子油是否抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录激活。如图4所示，DHT刺激可增强LNCaP细胞中AR的转录活性，而灵芝孢子油则明显抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录激活活性，与DHT组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。

图4 灵芝孢子油抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录激活活性*与DHT组比较，P<0.01

3 讨论

前列腺癌是老龄男性最常见的非皮肤癌恶性肿瘤，在美国位居男性肿瘤死亡的第二位，而在我国其发病率呈逐年上升趋势。雄激素受体（AR）的激活是前列腺癌由雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性演进过程的关键。雄激素受体是由配体激活的一种转录因子，当无配体结合时，AR在胞质内与热休克蛋白相结合并呈无活性状态，当雄激素受体与双氢睾酮（DHT）结合，则与热休克蛋白解离，继而进入胞核内与靶基因启动子区雄激素反应元件（androgen response element，ARE）结合，调节与细胞生长、增殖相关的靶基因表达[12-16]。本研究初步探讨了灵芝孢子油对雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞中DHT诱导的细胞增殖、雄激素受体的激活及转录活性的影响，结果显示：灵芝孢子油不仅降低DHT刺激的LNCaP细胞的增殖活性而且抑制DHT诱导的前列腺癌LNCaP细胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而对其本底蛋白的表达水平无影响。此外，荧光素酶报告基因活性检测进一步表明灵芝孢子油则明显抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录激活活性。

已有的研究表明，灵芝孢子油具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等功效[1]。有关灵芝孢子油在抗肿瘤中的功能作用备受人们的关注，其可能的机制包括：激活凋亡效应蛋白Caspase3诱导凋亡，下调miR-21而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的血管生成等[6-10]。笔者在前列腺癌雄激素依赖的LNCaP细胞中研究显示灵芝孢子油降低DHT诱导的LNCaP细胞的增殖活性、雄激素受体的激活和其转录活性，提示在前列腺癌中灵芝孢子油可能通过调节AR的激活和转录活性而抑制前列腺癌细胞的生长。

雄激素受体（AR）不仅受DHT诱导激活，而且还受到细胞内自分泌生长因子或相关的信号通路的异常激活，AR的激活在前列腺癌发生和进展中发挥着关键的作用[16]。近年研究显示，在雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP中蛋白激酶（PKD1）过表达，DHT刺激可促使PKD1与AR直接结合于PSA（prostate specific antigen，前列腺特异性抗原）的启动子区[17]。本研究显示，灵芝孢子油降低了DHT诱导的前列腺癌LNCaP细胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而对其本底蛋白的表达水平无影响，提示灵芝孢子油可能通过抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的激活，进而抑制AR相关靶基因的表达，但是，灵芝孢子油是否通过抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的核内转位以及抑制AR哪些靶基因的表达还有待进一步研究。

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