益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱含量测定的应用研究*

尹金磊，关素珍

(河南省南阳市中心医院中药科，河南南阳 473000)

益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱含量测定的应用研究*

尹金磊，关素珍

(河南省南阳市中心医院中药科，河南南阳 473000)

目的:总结分析益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱含量测定的不同方法，为应用适宜、准确、可靠的方法测定益母草饮片中有效成分含量提供依据。方法:分析细管电泳法、紫外分光光度法、薄层色谱法和高效液相色谱法(HPLC)在含量测定上的优劣，针对盐酸水苏碱、益母草碱的的分子和含量特点，选择HPLC法测定益母草中盐酸水苏碱、益母草碱的含量，选取适宜的色谱条件和检测器进行检测研究，测定益母草饮片中二者的含量。结果:经多方面比对，HPLC法是测定盐酸水苏碱、益母草碱简便准确的方法，进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，盐酸水苏碱线性方程为Y=81065X+433.5(r=0.9997)，平均加样回收率98.83%，RSD为0.95%，益母草碱线性方程为Y=5202.64X-221.14(r=0.9998)，平均加样回收率98.62%，RSD1.41%。结论:本研究所选用的HPLC法在测定益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱的含量时专属性强、相关性好、重现性好、结果准确，是测定益母草饮片有效成分含量的可靠方法。

盐酸水苏碱;益母草碱;含量测定

益母草为唇形科益母草属植物的新鲜或干燥的地上部分，全草入药，始载于《神农本草经》，其性微寒、味辛、微苦，入心包、肝经，是活血调瘀、利尿消肿之要药，也是中医妇科良药，主要化学成分为生物碱类、二萜类、苯丙醇苷、挥发油、环形多肽等［1］，生物碱类为益母草的主要有效成分，盐酸水苏碱和益母草碱在其中含量较高，是评价其质量的主要指标［2］。目前盐酸水苏碱的含量测定方法有薄层扫描法、高效液相色谱法、毛细管电泳法［3］、比色法、紫外分光光度法、离子交换法等，薄层扫描法和高效液相色谱法(HPLC)较为多用［4］。益母草碱的含量测定方法也多采用HPLC法［5］。本研究采用HPLC法，盐酸水苏碱使用蒸发光散射检测器，益母草碱使用紫外检测器。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，PL-ELS2100蒸发光散射检测器，岛津 SPD-10Avp紫外检测器; ChemStation色谱工作站;色谱柱:Pgrandsil HILIC柱(250×4.6 mm 5 μm)，A gilent EdipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);METTLER AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试药

益母草饮片购自药材公司，经鉴定为唇形科植物益母草的干燥全草。盐酸水苏碱对照品(批号110712-200508，含量测定用中国食品药品检定研究院)、盐酸益母草碱对照品(安徽新星药物开发有限公司，纯度＞98%)。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。其他试剂如磷酸二氢钾(分析纯)、三乙胺(分析纯)、磷酸(分析纯)、醋酸乙酯(分析纯)、95%乙醇(分析纯)、中性氧化铝(100～200目)，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 水苏碱含量测定色谱条件 色谱柱: Pgrandsil HILIC柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20);蒸发光散射检测器(氮气流量2.5 L·min－1，漂移管温度90℃)，柱温: 30℃;1.0 mL·min－1流速。进样量对照品溶液10 μL，供试品溶液10～20 μL，计算用外标两点法对数方程。

2.1.2 益母草碱含量测定色谱条件 色谱柱: A gilent EdipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.01%，磷酸水溶液洗脱(24∶76);检测波长277 nm，柱温25℃，流速1.0 mL·min－1，进样量10 μL。

2.2 各溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取适量盐酸水苏碱和益母草碱对照品，分别加70%乙醇制成每毫升含盐酸水苏碱0.502 mg及每毫升含益母草碱35.12 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定样品细粉1.0 g放于锥形瓶，精密加50 ml乙醇，称定质量，水浴回流2 h冷至室温，再称定质量，减失的质量以乙醇补足、滤过，取续滤液供试品溶液即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按供试品溶液制备的方法，制备缺益母草空白样品。

2.3 线性关系考察

2.3.1 盐酸水苏碱 精密量取盐酸水苏碱对照品51.48 mg，置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成每1 ml含盐酸水苏碱1 mg(C= 1.0296 mg/mL)。对照品溶液制定:分别精密吸取此溶液1、3、5、7、9 ml放入10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度;分别精密吸取20 μL对照品溶液，按上述色谱条件进行分析并测定峰面积。表1显示，以进样量(μg)对峰面积A(μV·s)进行线形回归，得回归方程:Y=81065X+433.5，r=0.9997，表明盐酸水苏碱在2.0592～18.5328 μg之间呈良好的线性。

表1 盐酸水苏碱线性回归方程

2.3.2 益母草碱 精密量取盐酸水苏碱对照品125.13 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成每毫升含盐酸水苏碱2.5 mg(C= 2.5026 mg/mL)。对照品溶液制定:分别精密吸取此溶液1、2、3、4、5 ml放入10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度;分别精密吸取10 μL对照品溶液，按上述色谱条件进行分析。表2显示，以进样量(μg)对峰面积A(μV·s)进行线性回归，得出回归方程:Y= 5202.64X-221.14，r=0.9998，表明盐酸水苏碱在2.5206～12.513 μg之间呈良好的线性。

表2 益母草碱线性回归方程

2.4 精密度考察

精密吸取盐酸水苏碱、益母草碱对照品溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样5次，每次20 μL，测定峰面积。5次试验测定的相对标准偏差低于2%，表明仪器具有良好的精密度。

2.5 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液，依上述色谱条件分别于0、2、4、6、8 h各进样20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。结果表明，供试品溶液中盐酸水苏碱、益母草碱在8 h内稳定。

2.6 重复性实验

同一批样品取6份，按照拟定测定方法，测定出盐酸水苏碱平均含量为1.21%，RSD为1.03%(n =6)，益母草碱平均含量为0.0486%，RSD为1.8% (n=6)，结果表明该法重现性良好。

2.7 回收率实验

采用加样回收法，精密称取已测知含量的益母草细粉约0.6 g5份，加入盐酸水苏碱对照品约2 mg/mL，另取5份加入益母草碱对照品0.5 mg/mL，按“2.2.2”项下制备供试溶液，按上述色谱条件测定。计算盐酸水苏碱、益母草碱回收率98.83%、98.62%，RSD为0.95%、1.41%。

2.8 样品含量测定

表3显示，分别取3个批号的益母草药材样品，按供试品的制备方法进行处理，精密吸取对照品溶液和样品溶液20 μL，分别进样测定峰面积，计算含量。

表3 样品测定结果

3 讨论

经现代药理研究显示，盐酸水苏碱和益母草碱是益母草饮片中的有效活性成分，对益母草饮片的质量检测多以盐酸水苏碱作为对照。益母草饮片中益母草碱含量略低于盐酸水苏碱，但也具有很强的生物活性，因此益母草碱的测定具有重要价值。

测定盐酸水苏碱含量的方法较多，有雷氏盐比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法(TLC)、高效液相色谱紫外检测器(HPLC-UV)法、高效液相色谱示差折光检测器法(HPLC-RID)或高效液相色谱蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)等。TLC法有许多优点，其操作方便、设备简单、显色容易等，然而TLC法定量准确性差、影响因素多，因而更多的研究采用HPLC法测定盐酸水苏碱的含量，选用的检测器主要是UV、RID和ELSD。UV是基于溶质分子吸收紫外光原理设计的检测器，适用于具有紫外或可见光吸收基团的有机分子，具有紫外或可见光吸收能力的物质检测。一般当物质在200～400 nm有紫外吸收时，考虑用UV。UV灵敏度高、线性范围宽、噪音低、有较好的选择性，且稳定性强，对于环境温度、流动相组成和流速的变化敏感度低，可用于制备色谱，但对紫外吸收差的化合物灵敏很低。由于盐酸水苏碱的紫外吸收为末端吸收，且其极性较大［6］，因此UV检测基线不稳定影响检测结果［7］。RID是高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱检测器，RID对所有物质都有响应，是一种通用型检测器，具有广泛的适用范围，对没有紫外吸收的物质都能够检测，且样品处理只需超声处理，不要再过离子交换柱净化。但与UV比较，RID的灵敏度较低，一般不用于痕量分析。由于盐酸水苏碱的结构中有旋光性的特点，也可考虑采用高 HPLC-RID法测定其含量［8］，只是该方法国内应用较少，条件并不成熟，且专属性不强，灵敏度低，与梯度脱洗不相容，还需进一步研究。ELSD是通用型检测器，紫外区无吸收的有机物质可以应用其进行检测，ELSD不同于荧光和紫外检测器，它很好地解决了传统HPLC检测方法中常见的问题。挥发性低于流动相的样品均能被ELSD检测，它的响应不受样品光学特性和官能团的影响。ELSD还用于测定样品的纯度或者检测未知物，因为其响应值与样品的质量成正比。盐酸水苏碱基本无紫外吸收，故采用具有更高灵敏度的ELSD进行检测。色谱柱选用Pgrandsil HILIC柱，是因为盐酸水苏碱具有很大的极性，应选择亲水作用色谱模式进行分离，因为亲水作用色谱可为强极性的化合物提供较合适的保留，而传统反相色谱不能很好地保留和分离，通常在死时间流出，所以不建议选择［9］。

益母草饮片为临床常用中药品种，建立统一的质量标准，是保证患者用药安全有效的前提，因此对于其中有效成分的检测方法应引起足够重视。按照《中国药典》［9］2010版要求，益母草饮片中盐酸水苏碱的含量不得少于0.40%［10］。故应系统总结科学分析，选取最优化准确的测定方法。本研究所选用的HPLC法在测定益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱的含量时，专属性强、相关性好、重现性好、准确度高，是测定益母草饮片成分含量的有效方法，为益母草饮片中盐酸水苏碱、益母草碱含量测定的应用研究提供了可靠的依据。

［1］赵彩霞，蔡长春，张增巧，等．益母草的药理作用及临床应用研究进展［J］．临床误诊误治，2011，24(2):82-84．

［2］蒋歆，丁永辉，魏学冰，等．HPLC-ELSD测定八珍益母丸中水苏碱的含量［J］．中成药，2011，33(3):542-544．

［3］罗毅，文为，周本宏，等．高效毛细管电泳法测定益母草总碱中盐酸水苏碱的含量［J］．山西医药杂志，2011，40(10): 1036-1037．

［4］杨琼．HPLC法测定益母草药材中盐酸水苏碱含量［J］．中国中医药咨讯，2011，3(1):17-18．

［5］郝巨祥，鞠延玲，刘海洋，等．HPLC测定抗宫炎软胶囊中益母草碱的色谱条件的研究［J］．中医药学报，2011，39(5):73-75．

［6］陈婷，莫灼康．中药材益母草中水苏碱含量鉴定分析［J］．中国现代药物应用，2012，6(13):133-134．

［7］王晓燕，王舒．HPLC-ELSD法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱的含量［J］．实用医药杂志，2012，29(6):523-524．

［8］黄强增．HPLC-RID法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱含量［J］．海峡药学，2012，24(11):63-65．

［9］张文婷，黄伟，王伟胜，等．不同采收期童子益母草中生物碱含量比较［J］．医药导报，2013，32(2):218-220．

［10］国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:272-273．

R285．5

A

1006-3250(2015)04-0459-02

2015-01-09

河南省卫生厅重点督办项目(HW-2010BNO．033)

尹金磊(1973-)，女，副主任药师，从事中药学和临床中药学的研究。