不同流域光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)子一代及其亲本的线粒体COI基因遗传变异分析＊

舒 琥 岳 磊 李 强 蓝昭军 谷平华 王杭军 吴土金

(1.广州大学生命科学学院 广州 510006;2.韶关市水产研究所 韶关 512006)

光倒刺 鲃(Spinibarbus hollandi),隶属鲤形目、鲤科、亚科、倒刺 鲃属,主要分布于长江以南各水系(广西壮族自治区水产研究所等,1981),具有体形好、肉质佳、食性杂、适应性强、生长快等优点。目前,由于江河污染的加剧和人类无限制的捕捞,致使自然资源逐渐减少,到了濒危的边缘,因此 光倒刺 鲃的人工繁殖愈加受到重视,繁育技术取得较大的发展(邓维德等,2013)。线粒体DNA(mtDNA)是真核生物的核外遗传物质,具有基因组结果简单、编码效率高、进化速率快、无组织特异性和母系遗传等特性(董丽娜等,2011),特别是其中的COI基因具有进化速率适中等特性,可作为系统进化研究的良好标记(付景等,2006)。 本实验对光倒刺 鲃杂交子一代及其亲本的COI基因进行了测序分析,不仅为光倒刺 鲃杂交子代的mtDNA遗传效应的研究提供理论基础,同时对光倒刺 鲃新品种的选育具有指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

DNA提取采用上海生工的试剂盒,DNA放置在–80°C保存备用。扩增 COI全序列的引物序列为:COI-F: GGGGCTGATAGGAAGAGGAC,COI-R: TTC GATTCCTCCCTTCCTCG。反应总体积为25μL,其中ddH2O 7.5μL,Mix 12.5μL,模板 DNA 3μL,上下游引物各 1μL。反应程序为: 95°C预变性5min,94°C变性30s,53°C退火30s,68°C延伸2min,共30个循环;最后68°C延伸5min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。

对测序结果进行人工拼接与矫正,然后将校准过的序列与已发表的光倒刺线粒体全基因序列进行比对,验证所测得片段就是所需要的目标序列。最后将该校准的序列以 FASTA格式文件保存。运用MegAlign进行序列间相似度的比对和差异性分析,而其中的碱基含量、变异位点、简约信息位点及序列碱基间替换情况则运用MEGA5.0统计(Tamura et al,2007),同时采用 Kimura双参数模型(Kimura,1981)计算遗传距离,构建NJ系统发育树。

2 结果与分析

2.1 COI基因的PCR结果

在6组共18 个光倒刺鲃个体中均扩增出约1800bp的片段如图1。

图1 光倒刺 鲃mtDNA COI基因片段扩增结果Fig.1 The PCR amplification products of mtDNA COI genes of S.hollandi

2.2 COI基因序列及其碱基组成

对 PCR扩增出来的片段进行序列测定,对比得到6 组光倒刺mtDNA COI 1551bp的碱基序列,由于其中有 6个碱基插入导致对比出来的序列长为1557bp(除去部分 tRNA-Tyr基因序列和部分的tRNA-Ser基因序列)。在 18 个光倒刺 鲃个体的 COI基因序列中,共检测到 35个可变核苷酸位点,其中28个简约信息位点,另外1522个为保守核苷酸位点。长江的2 个光倒刺 鲃母本和北江的3 个光倒刺 鲃母本共享一个单倍型(C-1),另一个长江的光倒刺 鲃母本单倍型为(CC-1),长江的3 个光倒刺 鲃父本和北江的3 个光倒刺父本共享一个单倍型(X-1),长江光倒刺母本与北江光倒刺 鲃父本杂交子一代 3个个体共享3个单倍型(Z-1,Z-4,Z-5),长江的光倒刺 鲃父本与北江光倒刺母本杂交子一代3个个体共享2个单倍型(Z-2,Z-3)。其中18 个光倒刺 鲃个体的COI基因序列中 T、C、A、G碱基的平均含量分别为 29.9%、25.4%、27.2%、17.5%。

2.3 COI基因核苷酸序列同源性分析

6组18 个光倒刺 鲃个体的 COI基因同源性在98.1%—99.9%之间。子一代单倍型(Z-1)与母本 2种单倍型(C-1,CC-1)的同源性分别为99.4%、99.8%,与父本单倍型(X-1)的同源性为 98.5%。子一代单倍型(Z-2)与母本单倍型(C-1)的同源性为 99.7%,与父本单倍型(X-1)的同源性为 98.2%。子一代单倍型(Z-3)与母本单倍型(C-1)的同源性为99.6%,与父本单倍型(X-1)的同源性为98.2%。子一代单倍型(Z-4)与母本2种单倍型(C-1,CC-1)的同源性分别为99.4%、99.8%,与父本单倍型(X-1)的同源性为98.4%。子一代单倍型(Z-5)与母本 2种单倍型(C-1,CC-1)的同源性分别为99.4%,99.6%,与父本单倍型(X-1)的同源性为98.1%(见表 1)。

2.4 COI基因核苷酸序列的变异位点分析

对光倒刺 鲃杂交子代的单倍型与其亲本的单倍型进行了序列比对(如图2)。其中存在碱基的插入与缺失,分别为在第 612位点单倍型(Z-2)插入碱基 G,在第715位点单倍型(C-1,Z-5)插入碱基G,在第745位点单倍型(C-1)插入碱基 C,在第 845位点单倍型(CC-1)插入碱基C,在第856位点单倍型(Z-5)插入碱基 T,在第 879位点单倍型(Z-4)插入碱基 T,在第1556位点单倍型(C-1,Z-5)存在碱基缺失,在第1557位点处单倍型(Z-1,X-1,Z-3)插入碱基C。除了碱基的缺失与插入,还存在碱基的转换与颠换。在子一代单倍型(Z-1)与其母本 2种单倍型(C-1,CC-1)和父本单倍型(X-1)分析中,发现 28个变异位点,其中子一代单倍型(Z-1)与母本单倍型(C-1)有 4个变异位点,即在第317、350、758、1214位碱基分别为C、T、A、T,而母本在相应位点分别为T、A、G、C,父本在相应的位点分别为C、T、A、T,子一代单倍型(Z-1)与母本单倍型(CC-1)分析中,发现 1个变异位点,即在第80位点碱基为A,而母本相应位点分别为G,父本在相应位点为A。在子一代单倍型(Z-4)与母本单倍型(C-1,CC-1)和父本单倍型(X-1)分析中,发现28个变异位点,其中子一代单倍型(Z-4)与母本单倍型(C-1)有 5个变异位点即在第 317、350、758、975、1214位,碱基为C、T、A、T、T,而母本在相应位点为T、A、G、C、C,父本在相应位点为C、T、A、C、T。在子一代单倍型(Z-4)与母本单倍型(CC-1)分析中共1个变异位点,即在第80位点碱基为A,而母本在相应位点分别为G,父本在相应位点分别为A。在子一代单倍型(Z-5)与母本单倍型(C-1,CC-1)和父本单倍型(X-1)分析中,发现 30个变异位点,其中子一代单倍型(Z-5)与母本单倍型(C-1)分析中共 5个变异位点,即在第 317、350、758、784、1214位点,碱基分别为C、T、G、C、T,而母本在相应位点为T、A、C、T、C,父本在相应位点为 C、T、C、T、T。在子一代单倍型(Z-5)与母本单倍型(CC-1)分析中发现 3个变异位点,即在第80、778、784位点,碱基分别为A、G、C,而母本在相应位点分别为G、C、T,父本在相应位点分别为A、C、T。

表1 6组光倒刺鲃COI基因核苷酸同源性Tab.1 The nucleotide homology of COI gene in 6 groups of S.hollandi

2.5 COI基因的系统进化树分析

3 讨论

线粒体基因已广泛应用于许多生物个体的遗传变异分析和系统进化方面的研究,其中应用细胞色素氧化酶 I(COI)进行遗传背景研究的文献报道已经有很多,王太等(2015)分析了 DNA 条形码在鱼类物种鉴定中的应用;黄燕(2014)进行了长江特有鱼类DNA条形码的研究;丁春(2014)通过 COI基因进行了河南四种鳊亚科鱼类遗传差异分析;谢佳燕等(2013)通过COI 鲌基因进行鲤科 属药用鱼类线粒体的DNA条形码研究;有学者对东亚特有鲤科类群的DNA条形码及其系统发育进行了研究(彭居俐,2007;彭居俐等,2009),利用 DNA 鲌条形码对鲤科 属鱼类物种进行了鉴定;均表明 COI基因具有良好的物种识别能力和保守性。

对于在鱼类中杂交背景的序列变异研究也有很多报道,徐晖等(2 0 0 7)分析了雌性褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)和雄性夏牙鲆(P.dentatus)及其杂交子一代的线粒体DNA 16S rRNA基因部分序列的遗传特性,发现杂交子代的16S rRNA序列与母本褐牙鲆的序列是一致的,遵循母性遗传的规律。周翰林等(2012)进行了两种杂交石斑鱼子一代及其亲本的线粒体 COI基因遗传变异分析,表明杂交子代遵循母性遗传的特征。郑乐云(2014)对云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)杂交子一代线粒体相关基因的母性遗传特征进行了分析,表明杂交子代同样是严格遵循母性遗传的。然而郭新红在研究杂交多倍体鲤发现,异源四倍体鲫鲤与其父本鲤和母本红鲫的线粒体 DNA 16S rRNA是遵循母性遗传的。但发现以日本白鲫(Carassium auratus cuvieri)为母本、异源四倍体鲫鲤为父本杂交获得的三倍体湘云鲫的mtDNA存在父性遗传现象,说明线粒体 DNA在杂交过程中主要表现为母性遗传,同时也存在父性遗传的特殊情况(郭新红,2004)。对于线粒体DNA的父性遗传现象在其他物种中也有报道,分别在哺乳动物(Shitara et al,1998;Schwartz et al,2002)、鸟类大山雀(Kvist et al,2003)、比目鱼(Platichthys flesus)、昆虫(Lansman et al,1983;Meusel et al,1993)、贝类(Passamonti et al,2001;Dalziel et al,2002;Hoarau et al,2002)等物种中发现了不同程度的父性遗传现象。

图2 6 组光倒刺 鲃的8种单倍型的mtDNA COI基因核苷酸比对Fig.2 Multiple alignment analysis for mtDNA COI of 8 haplotype in 6 groups of S.hollandi

图3 邻接法构建6 组光倒刺 鲃mtDNA COI基因系统进化树Fig.3 The Neighbor-joining phylogenetic tree of the mtDNA COI genes from S.hollandi

本研究使用相同引物扩增上述6 组光倒刺 鲃COI基因,通过分析表明杂交子一代光倒刺 鲃COI基因与母本光倒刺的单倍型同源性达到99.4%—99.8%,而与父本光倒刺的单倍型同源性为 98.1%—98.5%(见表 1)。杂交子一代与母本最多的有 9个[子一代单倍型(Z-4)与其母本单倍型(C-1)]位点不同,但是其呈分散分布,这可能是由于其母本 COI基因的个体差异造成的或者由人工育种造成的点突变。研究表明,虽然父母本为同种鱼类,但与其母本的变异水平明显低于与其父本的变异水平,表明光倒刺杂交线粒体COI基因严格遵循母性遗传的规律。

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