微透析技术在骨科的应用
2015-04-08张朕王丹朱泽兴张树明乔林
张朕,王丹,朱泽兴,张树明,乔林
1.同济大学 附属杨浦医院,上海 200090;2.第二炮兵总医院a.药剂科;b.骨科;北京 100088
微透析技术(microdialysis,MD)作为一种成熟、可靠的技术,依赖其自身优势,经过半个世纪的发展,已在临床前实验、药物开发、临床监测等领域得到广泛发展和应用。目前,FDA和CE已批准其应用于人类心肌、脑组织、肺和一些肿瘤的研究[1]。
MD 的快速发展与其先天的一些优势不可分割。单根微透析探针植入所造成的创伤仅相当于留置针,加上其多点取样、连续监测、极少量的体液丢失等优势,可配合多种检测设备实时监测使用,取得目标物纯度高,使人类的体内组织化学测定成为可能,而且在任何器官中都可行。经过近50 年的发展,目前MD 相关文献近20 万篇,广泛涉及心、脑、肺、肝、胆、肾、眼、耳、骨、肌肉、血液、皮肤、胚胎、前列腺等组织[1]。
同样,MD 在骨科也得到了非常广泛的应用。1996 年,Thorsen 把MD 应用于胫骨干骺端骨组织代谢检测。2003 年,Stolle 开创性地在骨皮质中利用MD探针检测抗菌药物局部浓度,次年他又将应用范围扩大到松质骨,与传统方法对比后,证实MD 在骨组织中的应用是可行的。2007年Bøgehøj撰文,正式把其作为一种研究方法进行系统的归纳总结[2]。微透析探针还可以作为局部用药的途径,应用于实验中[3-6]。在此,我们就MD 在骨科的应用做简要总结,希望对大家有所帮助。
1 骨科基础方面
MD技术在局部取样方面有独特的优势,特别是在局部代谢产物和药物浓度方面,但将MD 引入骨科基础进行广泛的研究则相对较晚,Thorsen 等在1996 年研究应力刺激下人骨组织前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)释放时首次把该技术引入基础研究,他们把MD 探针置于胫骨干骺端骨质较为疏松的部位,发现在应力刺激下,人胫骨近端的PGE2增长了2.5~3.5 倍,证实PGE2 与动态机械运动有明确关系。Korth 等在研究外科止血带对骨骼肌能量代谢的影响时,通过MD 配合高效液相色谱,发现在使用止血带30 min 后,目标肢体的葡萄糖水平下降了40%,而乳酸和次黄嘌呤的水平则上升了200%以上,胆碱水平也有大幅增加,而再灌注后葡萄糖的水平可以快速回升,但乳酸和次黄嘌呤的水平却持续增加,证实了松止血带后并不能及时有效地缓解肢体缺血情况,该实验结果认为缺血反而会加重[7]。Mikkelsen 利用MD 检测非甾体抗炎药(NSAID)的同时,把其也作为一种局部用药的途径,发现距离用药点1 cm 远处PGE2 的水平下降了85%,4 cm 处则下降了30%~50%,证明NSAID 类药物可以有效抑制PGE2分泌,在活体身上解释了NSAID类药物的作用机理[6]。随后,Britt 和Mackey 等分别进一步证实了这一结论,并认为运动诱导的自适应性(exercise-induced adaptive increase)同时被抑制了[8-9]。在研究运动对成骨的影响时,Keitaro 等利用MD 监测运动前后72 h 间志愿者骨碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BAP)和1 型C 肽胶原蛋白(procollagen type 1 C-peptide,P1P)的水平,发现BAP水平无明显变化,而P1P 在24 h 有明显增高,标志着体内胶原纤维形成加强[10]。为了减小MD 应用于人体骨骼肌的误差,Patrik针对该条件对相对回收率随时间变化做出校正,经过4~6 个月的监测,得出了MD长时间应用在人骨骼肌中,其相对回收率是稳定的结论,并认为低强度的运动对其没有影响,但会因具体项目和场合而异[11]。
2 慢性损伤方面
MD 在慢性损伤方面的应用主要集中于对肌筋膜疼痛综合征(myofascial pain syndromes,MPS)的研究。2004 年,Lars 等研究斜方肌慢性疼痛(trapezius myalgia,TM)时发现,患者肌肉内5-羟色胺(5-HT)和谷氨酸水平与疼痛强度、压痛阈值(pressure pain threshold,PPT)、无氧代谢密切相关。2005 年,Shah 利用MD 在活体研究MPS 评价了该类患者骨骼肌的生化环境,发现其质子、缓激肽(bradykinin,BKN)、降钙素基因相关肽、P 物质、肿瘤坏死因子α、白细胞介素(IL)1β、血清素和去甲肾上腺素的水平均高于正常人,而pH值却显著低于正常人。另一项研究中,又发现该类患者斜方肌间隙内的钾离子水平相对于正常人恢复到正常水平的时间明显延长,而白介素6 和乳酸脱氢酶的水平则保持正常。Gerdle 在2008 年发现2 种激肽类物质——BKN 和血管舒张素(kallidin,KAL)——也参与了痛觉过敏,他将TM 组和颈椎相关的疼痛分开观察,并设对照组,发现在20 min的低强度运动和休息后,KAL和BKN 均明显增高,KAL 最高见于颈椎组,而TM 组还是明显高于对 照,TM 组 的BKN 则明显高于其他2 组[12]。2011 年,Ghafouri 针对N-十六酰胺乙醇(N-palmitoylethanolamide,PEA)和N-硬脂酰乙醇胺(N-stearoylethanolamide,SEA)进行检测,发现它们在TM 患者斜方肌中的浓度同样明显高于正常人[13]。Larsson和Sjøgaard 认同以上观点,前者针对体力劳动8 h后的MPS 患者,而且发现肌电图(EMG)结果、工作强度评定结果、精神紧张度似乎与这些代谢物质的变化没有明显关联[14-15]。然而Gerd 似乎不全认同这些观点,他在European Journal of Pain上撰文认为,针对斜方肌慢性疼痛的患者,在安静休息4 h 后,结果示PGE2和谷氨酸的水平与正常人并无统计学差异。
3 创伤骨科方面
在骨创方面,Yvonne 把MD 运用到Wistar 大鼠股骨创伤后24 h 细胞因子和生长因子的监测中,测定其总蛋白、IL-6的浓度,其中总蛋白的含量是不断下降的,5 h 后趋于平缓,而IL-6 在伤后即有明显增长,12~15 h 达到高峰,伤后24 h 后则已低于130 pg/mL,作者还试图检测TGFβ1,但没有成功,IL-6和TGF-β1为骨折愈合早期的标志性细胞因子,通过对其的检测,让我们在分子水平上对骨折愈合初期变化有进一步了解[16]。在研究不同等级的创伤后关节液代谢变化时,Stålman 引入了MD 来检测滑囊膜的炎性物质,如葡萄糖、乳酸、PGE2 等,发现冷敷和局部加压可以有效降低滑囊膜的炎性反应,PGE2的变化与温度密切相关,低温还可以有效降低乳酸水平[17];同时还发现,注射酮咯酸类药物对降低PGE2 的水平有明显作用,而吗啡在这方面没有明显反应[18]。机体对创伤的反应是一个大课题,但基于分子水平代谢的变化了解并不全面,”中间过程”是模糊的,而MD为我们提供了一种简单可行的方法。
4 关节外科方面
Stålman 针对关节发表的一系列MD 应用文章中,对关节镜手术后滑囊膜的物质代谢进行检测,发现在关节镜前交叉韧带(ACL)重建术后,以简单关节镜术和对侧大腿的脂肪组织为对照,ACL 组常规术前应用吗啡,术后低温和加压处理,结果显示关节镜组滑囊膜乳酸、糖代谢水平术后相对于对照组明显增高,相对于ACL 组无明显差异,但PGE2 明显低于ACL 组,作者认为ACL 重建术较关节镜术并未增加炎症反应[19]。而且关节镜术后,滑囊膜的糖代谢和PGE2 水平均上升,同时疼痛感也明显加重,他们认为这两者呈正相关关系。Högbergy 也得出了同样的结论,并发现术后应用类鸦片类药物可减轻葡萄糖和PGE2 的水平。他还研究了儿茶酚胺类物质对膝关节镜术后滑囊膜的影响,并利用微透析探针局部用药,发现实验组乳酸均成倍增长,肾上腺素可有效降低葡萄糖和血流水平[4]。2010 年,Helmark 针对早期骨性关节炎(osteoarthritis,OA)做了一系列研究,他在超声引导下,向关节内和滑膜临近组织放置微透析探针,并在微透析灌流液中添加放射性标记葡萄糖,检测几种关节炎相关物质——软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、软骨蛋白多糖核心蛋白(cartilage-specific proteoglycan core protein,CSPCP)和葡萄糖-半乳糖化吡啶啉(glucosyl-galactosyl-pyridinoline,Glc-Gal-PYD),结果显示COMP 和Glc-Gal-PYD 在关节内明显高于滑膜周围组织,CSPCP未见明显差异,他们认为利用MD对骨性关节炎进行检测切实可靠,并有良好的应用前景[5]。在另一组实验中,他们将31名OA 患者随机分为运动组(NEx)和非运动组(Ex),在3 h 锻炼后,发现Ex组关节内IL-10的水平明显高于NEx组,而IL-6 和IL-8 在2 组中均增高,Ex 组的COMP 则明显低于NEx组,证明软骨保护类抗炎药可能对OA患者是有益的[6]。目前对于股骨头缺血性坏死的发病机制,有人认为不单单是因为股骨头动脉血供较差引起,静脉回流受阻造成骨内高压也可能是一种机制。依据这一学说,Bøgehøj 和Lorenzen 利用MD 对股骨头的缺血进行研究。Bøgehøj 在骨质上开直径略大于MD 探针的洞,以便微透析探针置入检测,完善MD 应用于监测股骨头缺血的方法[2,20];此后,他又配合体外实验进行对比,发现由于在股骨开洞略大于微透析探针,期间会存在一个间隙,加上放置探针时的操作,会对实验结果初期产生影响,但认为在一个平衡期后,实验结果是真实、可靠的[21]。Lorenzen则在研究股骨头表面置换术的手术入路时引进了MD,股骨头表面置换术入路的选择主要有后侧入路和前外侧入路2 种,但哪种入路对术后血液供应影响最小却没有客观的依据。Lorenzen 在术中把MD探针直接放置在股骨头的上象限,通过术后观察发现,后入路较前外侧入路缺血更为严重,而2 种入路在血流方面没有区别[22]。
5 骨科感染方面
在治疗糖尿病足方面,Traunmüller 用MD 评价糖肽类抗生素达托霉素对糖尿病足患者发炎的皮下脂肪和骨组织的渗透能力,认为每日1 次静脉注射6 mg/kg体重的达托霉素,可在足皮下脂肪和跖骨达到有效浓度,可有效治疗糖尿病足和骨髓炎[23]。他用相同方法对另一种唑烷酮类的抗生素利奈唑胺做了相关评价,认为每日2 次静脉注射600 mg 可有效治疗糖尿病足和骨髓炎[24]。随后Schintler 对大剂量的磷霉素做了类似研究,静脉注射100 mg/kg 体重的磷霉素,其在跖骨中可以达到有效浓度,同样是治疗糖尿病足感染的良药[25]。2014年,Tøttrup利用MD分析头孢类抗生素头孢呋辛在猪皮质骨和松质骨的药代动力学,在游离血浆、表皮、松质骨和皮质骨4组目标物中,5 h 后分别取得了6013±1339、3222±1086、2232±635 和952±290 μg/mL 的结果,分析发现头孢呋辛在松质骨和皮质骨的代谢明显不同,并认为骨组织对于头孢呋辛可以认为是一种隔室[26]。在研究抗菌药物方面,MD 是非常成熟的技术,也是一个非常好的工具。
6 显微外科方面
MD应用于怀疑缺血的部位,可尽早判断局部组织血供。早在1998 年,Röjdmark 就开创性地将MD应用于游离皮瓣的缺血监测,开启了MD 在游离皮瓣研究中的应用,并成功地发现了血栓和血肿的发生。Udesen在对横行下腹直肌肌皮瓣的监测中明确指出,当皮瓣发生缺血时,葡萄糖下降而乳酸丙酮酸水平是上升的,这种差别有统计学意义,而在再灌注结束后,这些变化均可恢复正常,在1 例因动脉血栓形成导致的失败病例中发现,其中葡萄糖浓度低到不可检测,乳酸浓度增高后因缺少葡萄糖而停止,丙酮酸的浓度在非常高的水平。作者从而得出结论:MD可以用于监测游离皮瓣早期缺血,使早期手术成为可能。2004 年,Setälä在猪模型上系统、科学地证实了以上结论,并指出静脉性缺血要比动脉性缺血乳酸水平更低,乳酸丙酮酸比值和乳酸葡萄糖比值更高,利用这些发现可以判断缺血的性质[27]。同理,MD 还被应用于颌面部皮瓣[28]和腓骨游离皮瓣的监测[29]。在研究颌面部皮瓣时,由于其特殊性,面部自觉、不自觉的活动可能对皮瓣的预后包括疤痕大小造成影响,因此在整形手术中常用镇静剂,于是Silvia利用MD和氧分压评价了右美托咪啶应用于游离肌皮瓣移植术后,发现右美托咪啶在再灌注和局部组织代谢上对肌皮瓣无不良影响,认为可以应用于颌面部游离皮瓣移植术后肌肉镇静[30]。
7 脊柱方面
目前,MD在神经外科从临床前阶段到临床阶段都得到广泛应用,已有多篇相关综述。同样,在脊髓方面的研究也有大量文献,大部分是关于神经疼痛代谢方面的。Brodin 利用MD 对猫脊髓后角释放P物质进行研究,将MD 引入脊髓研究方面[31]。Parrot提出把毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测(CELIFD)与MD 配合,检测人脊髓后角的γ-氨基丁酸、丙氨酸、左旋天门冬氨酸在围手术期的变化,认为该检测方法准确且高效,较其他方法有独特优势[32]。MD还可用于检测神经鞘内天门冬氨酸、谷氨酸或一氧化氮,Hsieh发现其中的酮咯酸类药物可以在脊髓损伤后引发这2 种物质的浓度升高,对小鼠脊髓干缺血起到保护作用[33]。MD 探针还可置入脊髓,检测其细胞外液目标物质的水平,Tsai 通过检测小鼠脊髓损伤前后细胞外液维生素C 的浓度来评价脊髓损伤,发现损伤后小鼠脊髓细胞外液中维生素C 的浓度是逐渐增高的[34]。他喷他多是一种通过激动μ型阿片受体和抑制去甲肾上腺素再摄取的镇痛药,在研究其对脊髓性疼痛的作用效果时,Thomas 将MD探针置入小鼠脊髓,检测到他喷他多提升了脊髓内去甲肾上腺素的水平而对5-HT没有明显影响,成功地抑制去甲肾上腺素再摄取[35]。Okon在研究急性脊髓挫伤与挤压伤后不同代谢产物的反应时,把MD探针与脊髓成30°角深7 mm 置于猪脊髓T9、T10 水平,发现挫伤后乳酸和丙酮酸的水平在近中心的部位均上升,葡萄糖则保持稳定,在持续给予挤压后,乳酸水平有短暂上升,葡萄糖和丙酮酸水平快速下降,认为这一现象可能与脊髓干血运受阻有关[36]。
8 骨肿瘤方面
Ekstrøm 对大剂量甲氨蝶呤治疗股骨恶性纤维组织瘤采用连续瘤内微透析技术,认为这是一种研究癌症药物治疗局部药物暴露与疗效关系的非常有用的方法。Thompson 对马法兰ILI(isolated limb infusion)治疗肢体恶性肿瘤进行研究,发现马法兰峰值和浓度在血浆中明显高于皮下和瘤内,认为肿瘤对马法兰并没有优先摄取,而肿瘤的反应与马法兰的浓度有直接关系,他们认为MD 非常适合ILI 用药的检测[37]。Brunner 总结了MD 在肿瘤方面的应用,并与影像学方法和传统方法做了对比,认为MD 在化疗药物的开发中同样具有广泛前景[38]。
MD作为一项技术已走过半个世纪,在很多方面得到广泛应用,但其临床应用更多是在神经外科方面,而且已经非常成熟。以上我们总结了MD 在骨科方面的应用。MD 的一些先天优势,如微创、定位取样、多点监测、连续取样、多种检测手段,可以让我们更深入地了解”中间过程”,通过MD 进行分子水平的检测,在骨科仍具有众多应用前景。
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