蛋白质组学在木薯育种中的应用

陈松笔 安飞飞 朱文丽 李开绵 Luiz JCB Carvalho 李庆孝

蛋白质组学是由基因组学一词衍生而来，即由一个基因组、一个细胞或一种组织通过转录翻译表达的所有蛋白质［1］。蛋白质组学以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞水平及生物体水平研究蛋白质的组成、结构、修饰及其功能［2］，从而在蛋白质水平探索其作用模式、功能机理、调节调控及相互作用［3］。近年来，蛋白质组学技术取得了长足的发展，随着新技术的不断涌现，其应用范围也不断扩大［4］。本文对蛋白质组学在木薯育种中的应用进行综述，并对其应用前景进行展望。

1 蛋白质组学工作平台

1.1 蛋白质组学及其主要研究内容

1994年，澳大利亚麦考瑞大学（MacquarieUniversity）的Wilkins和Williams首次提出了蛋白质组学概念，他们把蛋白质组定义为基因组表达产生的全部蛋白质，即某一个物种、个体、器官、组织或细胞基因组表达的全部蛋白质［5］。基因选择性表达及转录、翻译过程中的修饰，导致蛋白质随组织、发育时期和生长环境的不同而发生变化。这些变化不仅反映在蛋白质的丰度上，也反映在蛋白质翻译后的修饰和相互作用上［6］。蛋白质组学最有价值的优势是可以观察特定时间内一个完整蛋白质组在某种生理或病理状态中发生的相应变化［7，8］。目前蛋白质组学研究范畴主要包括四个方面：结构蛋白质组学（Structural proteomics）、表达蛋白质组学（也称比较蛋白质组学，Expression proteomics）、相互作用蛋白质组学（Interaction proteomics）和功能蛋白质组学（Functional proteomics），其中表达蛋白质组学应用比较广泛［9，10］。

1.2 蛋白质组学研究技术

1.2.1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳技术（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）是 O’Farrell在1975年建立［11］。到目前为止，仍然是全蛋白质分离的核心技术。其原理是根据不同蛋白质的等电点及分子量进行分离。优点在于：分辨率较高，最好的凝胶能够分离到10 000个点以上［12］，还可以对翻译后修饰（如糖基化、磷酸化等）进行分析。缺点是高丰度蛋白质点往往遮蔽掉稀有蛋白质和低丰度蛋白质，导致2-DE方法分离蛋白质灵敏度降低，尤其对疏水性蛋白质、极酸和极碱蛋白质分离效果不是很好。为提高2-DE方法灵敏度，可通过增加双向胶分辨率，分辨出具有相似等电点的蛋白质。对极高丰度蛋白质遮蔽问题可通过采用窄pH梯度胶条与预分级相结合的方法或者用亲和色谱去除极高丰度蛋白质方法来解决［10］。极酸和极碱蛋白分离可通过采用偏酸和偏碱性pH梯度胶条结合预分级方法来提高其分辨率［13］。

1.2.2 双向荧光差异凝胶电泳 针对2-DE重复性较差的问题，Unlu等［14］开发出双向荧光差异凝胶电泳技术（Two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis，2D-DIGE）。其原理是将3种来源不同的蛋白质分别用不同CyDyeTM荧光染料标记，混合后进行2-DE，并用相应激发波长来检测被不同荧光基团所标记的蛋白，配合全自动蛋白质表达分析软件精确分析测定不同蛋白质组之间的差异蛋白表达。这种方法克服了普通双向电泳技术的一些瓶颈，能够提高2-DE重复性和定量的精确度，还有助于2-DE整合到蛋白质组的自动化流程中去。目前，DIGE技术主要用于功能蛋白质组学，如对各种癌症的研究，寻找致病分子标记物，探究癌变引起的蛋白质变化等［15］。缺点是DIGE技术非常灵敏，目前许多质谱仪还没有足够的灵敏度来鉴定其分离出的蛋白质，且所用试剂非常昂贵，使之难于得到广泛应用。

1.2.3 同位素相对标记与绝对定量技术 如何系统地识别和定量一个蛋白质组是当今蛋白质组学研究的一个主要目的，因为蛋白质浓度对于其功能实现有着非常重要的作用［16］。美国应用生物系统公司在2004年推出一项新的体外同位素标记技术——相对和绝对定量同位素标记（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术［17］。iTRAQ 技术使用8 种（或4 种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8 种（或4 种）不同蛋白质样品［18］。iTRAQ技术已成为目前蛋白质组学定量方法中一项重要技术，其作用已经在许多生物体和组织研究中得到证明［19，20］。但iTRAQ 试剂容易受样本中杂质蛋白及处理过程中缓冲液的污染。此外，目前iTRAQ试剂仍非常昂贵，这在一定程度制约了它的广泛应用。

1.2.4 质谱技术 与传统的蛋白质鉴定方法相比，质谱分析技术具有灵敏、准确、高通量、自动化等特点成为当前蛋白质组学技术的支柱［21］。质谱鉴定蛋白质的基本原理是使样品分子离子化，然后根据不同离子间的质荷比（m/z）差异来分离并确定蛋白质相对分子质量［22］。质量分析方式和电离方式的不同组合形成了不同类型质谱。常见的离子化方式有电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光吸附电离（MALDI）。质量分析方式有离子阱、傅立叶交换离子回旋共振、飞行时间和四极杆分析。四种质量分析方式可独立使用，也可串联使用。例如，MALDI常常和TOF组合，来测定肽段质量。近年来，MALDI也和两个TOF联用［23］。质谱技术可用于磷酸化、糖苷化及其它蛋白质的修饰化研究［24］。

2 木薯育种中存在的问题

木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot Miller）植物，为世界3大薯类作物之一，块根淀粉含量20％-40％［25］，有“地下粮仓和淀粉王”美称［26］。木薯原产热带南美地区，有4 000多年的栽培历史；木薯是19世纪20年代由东南亚爱国华侨开始引入我国，首先在广东省高州市栽培，随后传入海南岛并遍及华南地区，至今有200多年的栽培历史。在我国木薯广泛分布于广西、广东、云南、海南、福建和江西等华南省区，长江流域一些地区也有种植［27］。木薯既是我国南部地区重要的淀粉工业和生物质能源原料，也是热带地区潜在的粮食安全有效补充。2015年9月17-18日国家木薯产业技术体系组织召开“中国木薯栽培技术发展战略研讨会”，与会木薯育种学家根据目前市场和木薯产业发展需求提出我国“十三五”木薯育种任务，即选育的品种除了含有高产稳产特性外［26］，还要具备以下某方面的特征：（1）薯型粗短、结薯集中、易机械化收获品种；（2）矮化密植综合抗逆性强品种；（3）富含蛋白质和类胡萝卜素及食用风味好的品种；（4）早熟抗寒北移品种。然而木薯遗传背景复杂，全基因组高度杂合，后代性状分离严重，还具有自交不亲和、种子数量少等特性，导致杂交选育种效率低下［25，26］等问题。因此，仅依靠传统的杂交育种手段很难实现上述的“十三五”育种目标［28-31］。近年来，利用高通量测序技术（Roche/454 或 Solexa）开展野生木薯近缘种M. esculenta ssp. flabellifolia（W14）与栽培品种M.esculenta ssp. esculenta（KU50）比较基因组学研究，完成了W14和KU50的全基因组草图，证实了木薯基因组的高杂合度，分别发现野生祖先种和栽培种的34 483和38 845个基因。注释了碳流、淀粉积累和氢氰酸合成代谢通路关键基因的生物学功能，并开发出数百万个全基因组分子标记［32］。但通过这些全基因组数据只能间接告诉我们蛋白质的功能，因为从基因表达的mRNA水平到最终合成蛋白质水平，这其中包含着蛋白质翻译的调控、糖基化、磷酸化等诸多因素，这些因素都有可能改变作为直接作用因子的蛋白质功能，因而直接研究蛋白质变化具有不可替代的意义，它们几乎负责细胞所有的生物化学活性。而采用蛋白质组学技术分析木薯不同种质及其亚细胞结构或不同生长时期的蛋白质组，通过解析它们的生物学功能、广泛而完整的认识蛋白质调控网络，发掘重要蛋白质群在代谢通路的协同调控机制，为蛋白质组学在木薯育种的应用提供了重要平台。

3 蛋白质组学在木薯育种中的应用

由于蛋白质组学能从全蛋白质角度提供植物细胞、组织或整株植物对环境胁迫的各种响应信息［33］，因此蛋白质组学技术在农业科学研究中得到广泛的应用。例如，分析水稻不育花粉［34］、小麦T 型细胞质雄性不育系［35］和矮杆大豆［36］的蛋白质组，揭示出与雄性不育或矮杆突变体相关的关键蛋白质群体，有助于从蛋白质角度了解雄性不育和矮杆相关蛋白质的生物学功能。通过研究植物对生物和非生物胁迫，如病虫害胁迫［37，38］、盐胁迫［33］、缺氧胁迫［39］和热胁迫［40］等的蛋白质组学，对农作物品质和产量改良有一定积极作用。目前蛋白质组学研究已经深入到亚细胞水平，亚细胞蛋白质组就是利用蛋白质组学技术来分析一种组织或细胞的某一亚细胞结构的蛋白质组成，它一方面降低样品复杂度，使分析简单化；另一方面可以相对富集相应亚细胞结构的低丰度蛋白质。Chen等［13，41］运用2-DE结合LCESI-MS/MS对细胞核、染色质和细胞骨架的蛋白质组进行全面分析，确定了30多种关键蛋白质在这3种亚细胞结构中的定位和功能，对揭示蛋白质的定位和功能信息具有重要价值。农作物亚细胞研究比较多的是叶绿体［42，43］和线粒体［44，45］蛋白质组，提供了功能基因组学的有用信息以及与这些组分生物发生相关的新组分鉴定等。本研究综述当前木薯蛋白质组学的研究成果，探讨蛋白质组学在木薯育种中的应用。

3.1 蛋白质组学在选育高光效和高淀粉积累种质中的应用

木薯鲜薯产量依靠块根淀粉的高效积累，而块根淀粉主要来源于光合作用同化物的高效转化。源（叶）是光合产物的生产和供应者，源是库（块根）的基础，库是光合产物积累、需求、消耗的器官，因此解析源、流、库的调控机制对挖掘木薯的产量潜力具有重要作用。陈霆［46］以不结薯的野生木薯（M. glaziovii）、结薯但产量很低的野生木薯近缘种W14和高产高淀粉木薯栽培种华南205（M. esculenta cv. SC 205）为研究材料，利用表达蛋白质组学技术对3种木薯功能叶片蛋白质组进行比较研究，同时结合叶片的组织结构、叶绿素含量及叶绿素荧光参数日变化数据，探讨木薯栽培种叶片高光效的分子机制。3种木薯叶片叶绿素荧光参数ΦPSⅡ日变化均呈先上升后下降的趋势，在上午11时均达到最大值，此时的净光合速率也均达到最大值，且栽培种SC205显著高于野生木薯和W14；根据蛋白质组学分析数据发现木薯栽培种SC205叶片中磷酸激酶等能量代谢、Rubisco、RCA等光合作用及淀粉合成相关的蛋白质群高水平表达，作为一种信号转导分子14-3-3蛋白质在栽培种SC205也上调表达，推测其可能参与源、流、库代谢通路的信号转导，从而提高栽培种SC205叶片的光合效率；通过Western blot分析参与光合作用通路的关键蛋白质，如Rubisco、PEPC、D1及OEC等的表达水平，也验证了这一结果，这些研究可为高光效、高产、高淀粉木薯新品种的选育提供理论参考。为进一步解析木薯块根淀粉积累的分子机理，中国热科院陈松笔研究团队通过采用双向电泳结合MALDI-TOF-MS方法测定野生木薯近缘种W14和高产高淀粉栽培种SC205及华南8号（SC8）块根蛋白质组发现，块根共有蛋白质103个，野生种特有蛋白质58个，栽培种特有蛋白质87个；从这些特有蛋白质中有可能筛选出高产木薯种质的标记蛋白质。宋红艳［47］以野生木薯M. glaziovii为对照，开展W14和SC205 块根淀粉合成和分解代谢通路的转录组研究。结果显示栽培种SC205和W14相比，与淀粉合成通路相关的蛋白酶活力提高，与淀粉降解相关的蛋白酶活力降低，研究结果从转录组水平支持了木薯栽培种SC205块根淀粉高积累的分子机制。

3.2 蛋白质组学在选育高蛋白质和高类胡萝卜素食用种质中的应用

木薯块根没有蛋白质体，缺少贮存蛋白质的功能［48］，这是木薯块根蛋白质含量（0.7％-2.5％，DW）普遍低于谷类作物（7％-14％，DW）的原因；许多长期以木薯块根为食的非洲国家，由于蛋白质营养不良表现出婴幼儿、儿童及青少年生长发育迟缓、消瘦、智力发育障碍和成人易疲倦、贫血、免疫功能下降、生殖功能障碍等征状。巴西国家农牧研究院Carvalho教授团队通过光学显微技术观察木薯不同种质的块根，发现蛋白质含量低的白心木薯块根（蛋白质含量为0.955％，DW）有色体数量少，而深黄木薯块根（蛋白质含量为6.12％，DW）的有色体数量是白心木薯的5倍以上；推测木薯蛋白质含量可能与有色体数量相关。木薯有色体是类胡萝卜素的载体，普通木薯类胡萝卜素含量低（2.4mg/g FW）［49］。Ceballos 等［49］和 Sánchez 等［50］利 用 杂交育种方法从2148份种质中筛选出高类胡萝卜素达25.8mg/g FW的种质，与含量最低的种质类胡萝卜素含量相差258倍。为解析类胡萝卜素在木薯有色体的高积累与有色体是否作为蛋白质积累的载体，可采用亚细胞蛋白质组对木薯块根有色体蛋白质进行全面分析，使蛋白质定位和鉴定变得更简单、快捷、准确和高效。如Carvalho 等［51］通过空间排阻色谱法（Size exclusion chromatography）从深黄木薯块根有色体分离出与类胡萝卜结合蛋白质及类胡萝卜非结合蛋白质两部分，然后采用LC-MS/MS质谱法鉴定蛋白质发现，与类胡萝卜结合蛋白质有83个，与类胡萝卜非结合蛋白质106个，其中超过一半以上的蛋白质都是HSP。类胡萝卜素的生物合成多种多样，是一个高度调控的过程。在光合作用组织里，类胡萝卜素积累在叶绿体膜上，而在非光合作用组织里，类胡萝卜素在有色体中积累。有色体是由白色体或叶绿体转变而来，有色体也能转变为叶绿体［52］，研究表明Or基因能够调控有色体分化和有色体-叶绿体之间的转变，Or 基因编码的蛋白质为 DnaJ-like cochaperone。DnaJ蛋白质的作用是与HSP70伴侣相互作用，共同进行蛋白质的折叠、组装，拆卸和易位［53］。Or基因不直接调控类胡萝卜素的合作，通过显微结构的分析发现Or 基因在植物原本不积累色素的部位引起白色体或淀粉体向有色体转变，成为类胡萝卜素贮存库，从而在不影响正常类胡萝卜素代谢通路的前提下促进类胡萝卜素积累［54］。Fibrillin蛋白质具有稳定蛋白质结构的功能［55］，在许多植物中均有发现，尤其在类胡萝卜素储存纤维型有色体中。通过利用亚细胞蛋白质组学方法，Carvalho等［51］发现 Fibrillin 和 Or 蛋白质位置是在类胡萝卜非结合蛋白质区域，表明这两个蛋白质间接参与类胡萝卜素积累的代谢通路，该报道验证了上述研究结果。Carvalho等［51］的亚细胞蛋白质组学研究还第一次揭示在有色体中与木薯块根蛋白质积累通路偶联的5个蛋白质，即HSP18.1，HSP21，HSP17.4，HSP17.6和 Or蛋白质，这些蛋白质的表达水平可作为衡量木薯块根蛋白质高积累的标记。通过亚细胞蛋白质组学研究还可以解析有色体类胡萝卜素积累与蛋白质含量偶联的主要环节［56］。因为木薯块根的白色体主要是淀粉体，当淀粉体向有色体转变后，为类胡萝卜的合成和积累提供了场所和载体，保证有色体结构稳定和功能发挥以及类胡萝卜素积累的持续，导致一系列蛋白质参与促成这些代谢过程的稳定运行，因而从总体上提高了蛋白质的含量。所以淀粉体向有色体转变的调控机制是提高木薯种质蛋白质积累的关键，这些研究结果为选育高蛋白质木薯种质提供了新思路［57］。

3.3 蛋白质组学在选育抗逆木薯种质中的应用

木薯为二倍体植株，染色体数为36［58］，其可利用茎秆作为种茎进行无性繁殖；通过人工诱变可获得多倍体，如利用秋水仙素诱导木薯腋芽，获得一系列木薯多倍体，增加遗传进化的多样化。多倍体育种不受开花授粉时间和气候环境的限制，灵活性较大［59］。木薯染色体加倍后，表型常表现出器官增大、性成熟晚及抗性增强等特点［60］。利用蛋白质组学方法研究多倍体，可从全蛋白质角度解析木薯多倍体抗性提高的分子机理。研究发现木薯NZ199四倍体参与光合作用、碳代谢与能量代谢及防御体系的蛋白质群表达水平均上调，说明NZ199四倍体的光合效率与抗逆性均显著高于其二倍体；通过分析四倍体和二倍体功能叶片叶绿素荧光参数ΦPSⅡ的变化及它们对盐胁迫的反应，验证了上述蛋白质组的研究结果［61，62］。为进一步从分子水平揭示多倍体对产量的影响，安飞飞等［63，64］利用蛋白质学方法研究SC8二倍体和四倍体功能叶片及块根的蛋白质组，发现四倍体叶片参与光合作用的相关蛋白质表达上调，而块根中参与淀粉合成的部分蛋白表达下调，说明四倍体光合效率较二倍体显著提高［63］，但鲜薯产量下降［64］；四倍体和二倍体叶片叶绿素荧光参数ΦPSⅡ变化及鲜薯产量分析结果支持上述蛋白质组学的研究报道；这些分析结果从分子水平为木薯多倍体种质的改良提供理论参考。

木薯为热带作物，对低温敏感。为促进木薯的北移，扩大我国木薯种植面积，满足淀粉生产企业对木薯原料的需求，选育耐低温木薯品种是国家木薯产业技术体系“十三五”的育种目标之一。通过利用蛋白质组学技术研究在5℃低温胁迫15 d木薯的叶片生理生化特性变化及其蛋白质组，发现低温胁迫后，叶片中参与光合作用、碳水化合物与能量代谢、蛋白质合成及生物防御等多个代谢通路的蛋白质群表达水平发生显著变化［65］。由于木薯在每年3-4月分经常遇到干旱，为从分子水平了解木薯对干旱的蛋白质响应机制，徐娟［66］利用蛋白质组学方法研究耐旱木薯品种华南124在干旱胁迫下叶片的蛋白质组，发现其叶片中参与光合作用、能量代谢及防御系统的蛋白质群表达水平上调，说明该品种抗旱能力较强，可在较为干旱地区推广种植；利用上述研究结果筛选出一批耐寒及耐旱木薯种质。

Li等［67］研究木薯SC8不同组织的蛋白质组，表明木薯块根含有102个特异蛋白质，它们在木薯组织、器官和细胞的生长发育过程中行使不同的生物学功能，块根不仅作为储藏营养的器官，还参与了大部分的生理代谢活动。但块根不耐贮藏［68］，在收获72h内快速出现采后变质，这种快速变质过程与收获过程中不可避免的机械损伤有关［69］，因此耐贮性一直是国际上木薯研究的热点［70］；木薯若保质期延长到几周，仅尼日利亚在20年间将会减少经济损失29亿美元［71］。通过研究国内两个主栽木薯品种在块根贮藏中的差异蛋白质组，发现信号转导、抗氧胁迫相关的蛋白质在贮藏过程中均有不同程度的变化，尤其是钙调素蛋白质（CaM），其在采收贮藏24h和72h后的表达量均出现明显上调。Ca2+作为信号分子是木薯块根采后腐烂调节的关键，Ca2+-CaM复合物体系的网络枢纽可能在调控整个木薯块根采后生理代谢中起着重要作用［72］。研究还发现块根皮层与薯肉的差异表达蛋白质分别参与碳水化合物和能量代谢、解毒、信号传导、蛋白质合成等代谢途径，而且木薯块根皮层相关蛋白质还具有构建防御系统及对薯肉起保护作用的功能，在贮存过程中其蛋白质降解较快，推测这些蛋白质也是块根延长贮存的关键调控蛋白质［73］。目前，正在进一步对CaM在采后腐烂过程中的生物学功能进行验证。

4 展望

蛋白质组学研究技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，如应用于鉴定参与防御和应激反应以及在改进作物突变体中的关键蛋白质群等。本研究从选育高光效、高淀粉积累、高蛋白质和高类胡萝卜素及高抗逆种质方面阐述蛋白质组学在木薯育种中的应用。随着木薯全基因组测序和组装工作的完成及基因组数据库的构建［32］，蛋白质组学的研究技术在木薯育种中的应用将会变得越来越重要。利用木薯全基因组草图和基因组数据库平台，可推测蛋白质的氨基酸组成和结构；利用蛋白质的保守结构域来推测该蛋白质在不同代谢通路的生物学功能及其相互作用关系，从而验证和阐明蛋白质在其调控网络中的重要生物学功能，建立木薯选育高光效、高淀粉积累、高蛋白和高类胡萝卜素及抗花叶和褐条病毒病种质的蛋白质生物调控网络，来创制具有优良特色的突变体，实现蛋白质组学对辅助木薯选育种中的重要作用。为了更好地解决木薯选育种中面临的挑战，进一步提高木薯选育种效率，除了依托木薯基因组学研究平台外，有必要在以下三个方面进行系统和深入开展蛋白质组学的研究。（1）强调多学科交叉研究，构建木薯综合大数据库：结合栽培生理、基因组、转录组、代谢组及系统生物学进行深入研究，从生理表象、基因转录、蛋白质翻译和修饰、主要代谢产物和次级代谢产物层面深入分析木薯表现型和基因型的关系，筛选出调控木薯产量性状和抗性等相关农艺性状的关键基因及重要蛋白质，并进行功能验证，为加快木薯选育种进程提供综合大数据库。（2）加强蛋白质相互作用研究：将鉴定到与木薯不同生理代谢通路相关的重要蛋白质群制作成蛋白质芯片，结合酵母双杂交和表面等离子共振技术等，高通量研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA及蛋白质-小分子等的相互作用，揭示木薯不同突变体生长发育、分化凋亡以及其生物调控机制等生命活动规律。（3）加深研究与代谢活动相关的蛋白质翻译后修饰机制：蛋白质翻译后修饰与蛋白质生物学功能密切相关，如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化等，分析这些蛋白质修饰与信号传导、细胞凋亡以及逆境胁迫生理代谢通路的相关性，为木薯选育种中开发与性状相关的标记蛋白质及更好地揭示其在生理代谢中的作用机理奠定坚实基础。

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