恶臭假单胞菌HspB的单晶培养及结晶条件优化

邬志杰 吴更 唐鸿志 许平

尼古丁是一类广泛存在于土豆、番茄和烟草等茄科植物中的天然生物碱［1］，尼古丁对哺乳动物能产生多种致病、致变、致癌效应，且易溶于水，会污染土壤及水环境［2-4］。利用微生物来代谢尼古丁，是治理尼古丁污染的一种有效方法。

恶臭假单胞菌S16是一株尼古丁高效降解菌［5］，其利用吡咯途径代谢尼古丁［6］：尼古丁经由N-甲基麦斯明、假氧化尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羟基-3-琥珀酰吡啶（6-Hydroxy-3-succinoyl-pyridine，HSP）、2，5-二羟基吡啶（2，5-Dihydroxy-pyridine，DHP）、N-甲酰马来酰胺酸、马来酰胺酸、马来酸及富马酸，最终进入三羧酸循环［7，8］。

2011年，单加氧酶HspB及其编码基因hspB被发现，其负责催化HSP转化成DHP［9］。HspB以FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸、氧化态）为辅基，以NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态）为辅酶，其催化底物发生羟化机制也已经明确［10］。HspB在整个尼古丁代谢途径中十分关键，将hspB基因缺失后，P. putida S16无法进行尼古丁代谢。因此，获得HspB的结构对于研究其结构与功能的关系十分有利。

通过基因工程构建重组质粒，在大肠杆菌中表达外源蛋白，获得高纯度的蛋白得到单晶，并用于X射线衍射，这是晶体衍射学常用的方法［11］。而前期研究也表明，可以通过大肠杆菌表达纯化得到可溶性的带有His标签的HspB蛋白。然而其晶体的培养却十分困难［12］。虽然His标签对于蛋白结构影响较小［13］，但也有文献报道切除His标签可能会有利于晶体的培养，值得尝试［14，15］，同时亦有许多蛋白结构是通过切除His标签的蛋白获得的［16-18］。

本研究在前期构建的表达质粒的基础上［12］，通过突变PCR定点引入TEV蛋白酶酶切序列，从而实现了其重组蛋白产物能够被TEV蛋白酶切割，达到去除His标签的目的，并利用该蛋白进行结晶研究。旨为后续获得该蛋白结构，阐释其功能和结构间的联系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌种 表达质粒pET28a-hspB（抽提自大肠杆菌DH5α），大肠杆菌DH5α 和大肠杆菌BL21（DE3）均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 FastPfu聚合酶购自全式金公司，Dpn I购自NEB公司，TEV蛋白酶（带有N端6×His标签）为本实验自制，酶质粒小抽试剂盒购自Qiagen公司，实验所用结晶试剂盒购自Hampton Research、EMBio、Jena Bioscience、Molecular Dimension等。其他常用试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 PCR仪（EDC 810）购自东胜公司，细胞破碎仪购自广州聚能，Ni2+-NTA填充柱料购自Qiagen公司，水平与垂直电泳仪和凝胶成像仪均购自上海天能，ÄKTA prime Plus 购自GE，紫外分光光度计（UV-1800）购自上海美谱达。

1.2 方法

图2 重组质粒pET28a-hspB-TEV-His构建示意图

1.2.1 引物设计、突变PCR及产物鉴定 为实现在重组HspB蛋白C端和6×His标签之间加入TEV蛋白酶酶切识别序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）。本研究以表达质粒pET28a-hspB为模板，并由此设计正反向突变引物。P1：5'-GAAAACCTGTATTTTCAGGGCCACCACCACCACCACCAC-3’；P2：5'-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCCTCGAGAAAGGTTTCCAT-3'。引物的5'端是TEV蛋白酶酶切识别序列对应的核苷酸碱基序列（下划线部分），3'端则是模板序列（P1的3'端是6×His标签的核苷酸碱基序列；P2的3'端是hspB基因3'端序列（GenBank登录号GQ857548.1）。由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。突变PCR反应体系：FastPfu 聚合酶0.5μL，5×FastPfu Buffer 5μL，5×stimulant 5μL，2.5mmo/L dNTP 1.5μL，模板质粒 0.5μL，上下游引物 0.5μL，以 ddH2O补至25μL。反应条件：94℃ 5min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 3min，25 个循环 ；72℃10min。产物鉴定：1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 重组质粒pET28a-hspB-TEV-His的构建 向20μL PCR 产物中加入 1μL Dpn I进行消化，37℃，2h。将处理后的PCR产物直接转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆。提取质粒送上海美吉生物医药科技有限公司测序。经Blast比对，测序结果正确的质粒命名为pET28a-hspB-TEV-His。

1.2.3 HspB 蛋白的诱导表达 将pET28a-HspBTEV-His转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，于卡那霉素抗性平板上筛选阳性菌落。取阳性单菌落接种于50mL液体LB培养基中，加入终浓度为50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培养过夜，作为种子液。以1 100的接种量接种到1 L液体LB培养基中，加入终浓度为50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培养至OD600为0.8，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），16℃，180r/min诱导过夜。4℃，4 200r/min离心收集菌体。以1 L菌对应20mL镍柱平衡液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）的比例重悬，并加入终浓度为100mg/L的抑肽酶、亮抑酶肽及250mg/L的苯甲基磺酰氟，混匀。

1.2.4 镍柱亲和层析 菌液于4℃进行细胞破碎（1300 bar，3次）后，4℃，14000r/min离心，去上清过镍柱两遍。镍柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）漂洗柱子两遍。镍柱洗脱液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，60mmol/L、200mmol/L咪 唑）5mL洗脱目的蛋白。SDS-PAGE分析。

1.2.5 TEV蛋白酶酶切 按酶与蛋白1 25的质量比加入TEV蛋白酶进行酶切。本研究中采用了两种酶切方法。柱上酶切法：将蛋白上清挂柱后漂洗两次，封闭柱子，然后加入5mL镍柱漂洗液，按比例加入TEV蛋白酶，混匀柱料，4℃过夜。收集漂洗液。透析酶切法：在洗脱液中按比例加入TEV蛋白酶，置于透析袋中，于1 L镍柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑）中 4℃漩涡过夜。

1.2.6 镍柱除杂 在柱酶切法中直接收集酶切后漂洗液即可；透析酶切法则需要将透析液流穿镍柱，收集流出液及漂洗液。两种方法都需要用500mmol/L咪唑洗脱液洗脱柱上没有酶切完全的蛋白和TEV酶，并进行SDS-PAGE检测。

1.2.7 凝胶过滤层析 预先用平衡缓冲液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT，1mmol/L EDTA）平衡 Superdex200 HiLoad 16/600 凝胶层析柱（流速1.0mL/min，压强上限0.4 MPa）至电导曲线平直。将收集的流出液及漂洗液注入5mL上样环中。用一个柱体积（约130mL）的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液。结合紫外吸收峰和SDSPAGE分析纯化效果。4℃，4 500r/min离心浓缩蛋白溶液，Bradford法测定蛋白浓度至12mg/mL，直接进行点晶或使用液氮速冻，并于-80℃保存。

1.2.8 SDS-PAGE分析 采用12％分离胶和5％浓缩胶制胶，电泳后使用考马斯亮蓝R250染色。

1.2.9 点晶 蛋白冰上解冻后，4℃，14000r/min离心5min后点晶。本实验采用悬滴扩散法进行结晶。使用48孔（24孔）结晶板，下槽孔中的结晶试剂为 80μL（160μL）。在硅化玻片上依次滴加 1μL 蛋白溶液和1μL结晶试剂，再将盖玻片反扣覆盖在池孔上并用凡士林密封空隙。恒温静置培养。定期在显微镜下观察晶体生长情况。

1.2.10 结晶条件优化 以Index 2试剂盒的第83个条件为基础，对结晶条件做进一步优化。优化蛋白浓度：尝试13.5、12、9.5和7.5mg/mL浓度蛋白进行点晶。设计正交实验对pH、沉淀剂和盐离子浓度进行优化：沉淀剂的浓度设置了以1％为单位，尝试了12个梯度；盐离子浓度以0.1mol/L为单位，尝试了12 个梯度；pH以0.1为梯度尝试了10个梯度；同时选择了不同的沉淀剂（PEG200-10000）、盐（各类镁盐及盐酸盐）和pH缓冲液成分（Mes、Bis-Tris和HEPES），确定最优生长条件。添加剂筛选：控制原结晶条件不变，在液滴中加入0.2μL添加剂（96种添加剂均来自Additive Screen试剂盒）后静置培养。优化培养温度：尝试4、8、14、18和20℃下培养晶体。最后也尝试了微接种法，以获得单晶。

2 结果

2.1 pET28a-hspB-TEV-His重组质粒的构建与鉴定

突变PCR反应后，扩增产物由琼脂糖凝胶电泳鉴定，在4-8 kb间可见一条与pET28a-hspB-TEVHis质粒理论大小（6.4 kb）相符的条带（图3）。该PCR产物中包含环装缺刻质粒（目的产物）和痕量模板质粒，经Dpn I消化后转化DH5α，挑取单菌落送测序，经比对，序列完全正确。

图3 pET28a-hspB-TEV-His重组质粒构建

2.2 HspB-TEV-His蛋白的镍柱亲和层析

菌体破碎后，离心收集上清，通过镍柱亲和层析纯化，经SDS-PAGE检测，在45kD处有目的蛋白条带（图4），与预期（44.6kD）一致。上清、洗脱液中均有目的蛋白，60mmol/L咪唑下可见少许杂带（66kD处），判断可在之后的凝胶过滤层析中去除，故合并洗脱液。可见，该重组蛋白表达高、可溶性好且杂蛋白较少。

图4 HspB-TEV-His蛋白的镍柱亲和层析

2.3 TEV蛋白酶酶切效果比较

柱上酶切法 经SDS-PAGE分析（图5），漂洗液中只有切除His标签的HspB（45kD），洗脱液中则存在酶切不完全仍带有His标签的HspB-TEV-His（45kD）和TEV蛋白酶（27kD）。

透析酶切法 经SDS-PAGE分析（图5），流出液中有切除His标签的HspB蛋白和少量TEV蛋白酶，洗脱液中有未切开的HspB和TEV蛋白酶。

两种酶切方法均可切除His标签，且保证较高的纯度。对比两者洗脱液，显然在柱酶切中未切开的蛋白比透析酶切更多，说明透析酶切效率更高。

图5 TEV蛋白酶酶切效果比较

2.4 HspB的凝胶过滤层析

Superdex200柱层析紫外吸收峰单一，峰型对称陡峭，位置在56管（78.4mL）处，此处对应于44kD，大小正确（图6-A），取对应峰位置的蛋白进行SDS-PAGE分析发现，纯化的蛋白为单一条带（图6-B），达到晶体初筛所要求的纯度。收集峰尖位置左右的5管蛋白进行浓缩。

图6 HspB的凝胶过滤层析

2.5 HspB蛋白结晶条件初筛

经过大量的初筛条件筛选后，在Index 2试剂盒（Hampton Research）的第83个条件下有晶体生长，条件为25％ PEG3350，0.1mol/L Bis-Tris pH6.5，0.2mol/L MgCl2，14℃。晶体呈薄片状，且有孪晶现象（图7-A），不适合X-射线衍射数据收集，需要做进一步的优化工作。

2.6 HspB蛋白结晶条件优化

确定的最优结晶条件是蛋白浓度7.5mg/mL，22％ PEG3350，0.1mmol/L Bis-Tris pH6.5，0.21mol/L MgCl2，18℃，1 50的比例加入晶种，蛋白溶液与下槽液体积比为2 1的条件下，能够获得立体的块状单晶（图7-B），该晶体在上海光源进行X射线衍射后发现分辨率达到了1.8 Å。

图7 HspB晶体的优化

3 讨论

本研究所采用经典的QuickChange定点突变方法［19，20］（图 2）：设计一对包含突变位点的引物，和模版质粒退火后用Pfu聚合酶“循环延伸”（聚合酶按照模版质粒延伸引物，一圈后回到引物5'端终止，再经过反复加热退火延伸的循环）。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎（Dpn I识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒因无甲基化而未被切开，因此得以成功转化（大肠杆菌体内修复缺刻质粒），即可得到突变质粒的克隆［21］。前期实验构建了pET28a-HspB质粒，表达纯化得到HspB-His蛋白，用于结晶研究。由于晶体质量较差，不能用于衍射［12］。蛋白C端序列存在超过30个氨基酸是非折叠区域（Foldindex预测），而这些氨基酸所形成的柔性肽段，会导致蛋白在构象上的不均一，阻碍晶体的生长［15］。然而完全或部分去除这些序列会导致蛋白不表达或沉淀（数据未显示），暗示着该序列对于HspB结构有着稳定作用。因此本研究选择去除其C端的His标签（6×His短肽也是柔性肽），以提升蛋白晶体的质量。

前期实验尝试插入凝血酶酶切序列，然后发现其无法被凝血酶切开。推测是由于其识别序列（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser）较短，仅6个氨基酸，且前3个氨基酸（Leu、Val和Pro）均是非极性氨基酸，在表达时可能被折叠进了蛋白疏水核，没有暴露在水环境中［22］；或者是由于其酶切位点在Arg和Gly间，由于空间位阻，导致无法切除目的氨基酸［23］。

本研究总结了前期实验的经验，选择了TEV蛋白酶作为工具酶，其主要考量在于：（1）其识别序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）更长，为7个氨基酸，且除了Phe疏水外，其余氨基酸皆亲水，不易被折叠进疏水核内；（2）其酶切位点位于Gln和Gly间，离蛋白更远，会减小空间位阻的影响。

TEV蛋白酶酶切时，需要解决了3个问题：（1）新增的步骤带来的蛋白损失问题；（2）保持蛋白纯度和性质的问题；（3）纯化路线的可操作性和时间问题。因此，本研究比较了柱上酶切和透析酶切的效率及纯化效果发现，虽然在柱酶切比较省时省力，然而酶切效率较低，这可能是由于TEV蛋白酶与底物HspB蛋白都带有His标签，因而结合在柱料上，发生的是固固反应，分子间接触几率不如溶液反应那么高，并且酶固定化后会降低酶活［24］；而透析酶切是溶液反应，在酶切的同时进行咪唑浓度的稀释，可以节省时间，方便下一步的镍柱除杂。因此最后选择了透析酶切的策略。

蛋白的均一性是由镍柱除杂和凝胶过滤层析来保证的。镍柱除去了未切开的HspB蛋白，保证产物中仅有不带标签的HspB蛋白，这是无法通过凝胶过滤层析实现的。均一性对于蛋白结晶的影响是很大的，因此为了保持最大均一性，只取凝胶过滤层析中紫外吸收峰半峰对应的5管蛋白进行浓缩点晶，而非整个紫外吸收峰对应的蛋白［25］。这是由于均一性越高，其蛋白的大小形状也越接近，在凝胶过滤层析中，也就越倾向于在同一位置出峰。

因此最终确定下来的纯化路线能够获得纯度高、较均一的HspB蛋白，并且没有降解存在。同时整个纯化过程都在4℃进行，在最终保存液中也添加了二硫苏糖醇以保护蛋白。

培养得到的单晶在上海光源进行X射线衍射后发现，虽然分辨率达到了1.8 Å，但是在后续处理数据时发现其仍有孪晶趋势，这可能是由于TEV蛋白酶酶切后留下的肽（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）具有一定的柔性所致，相比6×His标签，其在结晶条件（pH6.5）下带电性更少，因而减少了同性相斥的现象，更利于蛋白分子有序堆积［26］。因此接下来将继续优化C端序列，进一步提高其构象均一性。底物的存在有利于晶体的生长［27］，因此也将尝试进行与底物的共结晶，进一步优化晶体。HspB是恶臭假单胞菌尼古丁代谢通路中的关键酶，该途径中其他酶的结构多已见诸报道［28］，而HspB的结构仍旧未知。了解HspB结构不仅有助于理解其功能和结构之间的联系，完善整个吡咯途径，还对定向进化提高酶活及进行工业化应用具有积极的指导意义。

4 结论

本研究以恶臭假单胞菌HspB表达质粒pET28a-HspB为模板，通过PCR插入TEV蛋白酶酶切序列，测序验证重组质粒pET28a-HspB-TEV-His。选用大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，经过镍柱亲和层析、TEV蛋白酶酶切、镍柱除杂以及凝胶过滤层析获得高纯度蛋白。

优化结晶条件后，确定了单晶培养条件是蛋白浓 度 7.5mg/mL，22％PEG3350、0.1mol/L Bis-Tris pH6.5、0.21mol/L MgCl2，18℃，以1 50的比例加晶种，蛋白溶液与下槽液体积比为2 1的条件；单晶的分辨率达到1.8 Å。

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