转基因植物中标记基因去除方法的研究进展

郎遥玲管晓燕白国辉刘建国

（1.遵义医学院口腔学院，遵义　563000；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，遵义　563000）

转基因植物中标记基因去除方法的研究进展

郎遥玲1，2管晓燕1，2白国辉2刘建国1，2

（1.遵义医学院口腔学院，遵义563000；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，遵义563000）

随着越来越多的转基因植物品种的出现，转基因植物的环境安全及食用安全越来越受到人们的广泛关注。目前存在的问题之一是转基因植物中抗生素或除草剂抗性的选择标记基因的存留。为了提高转基因植物的安全性，将转基因植物中选择性标记基因去除，不仅利于同一转基因植物的多次操作，而且更容易被人们所接受。就目前转基因植物中选择性标记基因去除的方法及其优缺点进行了横纵向的比较，希望对相关研究领域方法的选择方向具有指导意义。

转基因植物；选择性标记基因；安全性

自1983年美国科学家首次探索并获得了转基因烟草以来，转基因植物受到了人们的广泛关注。1996年，首次开展转基因植物的商业化种植，至今全球已有28个国家及地区累计批准25种转基因植物进行商业化生产，包括以抗除草剂和抗虫为主的玉米、大豆、油菜及棉花等。2014年，转基因植物种植面积已达1.815亿hm2。转基因植物的环境安全及食用安全成为当今研究的热点。目前，植物遗传转化都要使用选择标记基因（Marker gene），这一基因被众多研究者运用得较为广泛，其主要是除草剂抗性和编码抗生素的基因。但是当转化完成后，选择标记基因将会失去其使用的价值，它的保留被认为是不可取的。因此，转基因技术的应用出现了一大难题，即如何去除选择性标记，且不含抗性标记。标记基因的安全性问题主要表现在：标记基因是否会传播到野生亲缘品种中，导致杂草获得此抗性后变成现有的除草剂杀灭不了的“超级杂草”；标记基因对人类机体能否产生毒物、抗营养的因子及潜在过敏原性；现有生态环境的平衡是否被破坏；抗生素的抗性基因转移到微生物中，使病原菌获此抗性，导致临床运用的抗生素无效。此外，同源依赖的基因沉默H（Homology—dependent gene silencing）可能会被选择性标记基因存在的结构所诱导，从而使转基因植物的遗传改良以失败告终。所以，在转基因植物中提高其安全性的有效手段之一是培育无选择标记基因的转基因植物，其中的有效策略是采取一系列措施在转化植株筛选完成后将选择标记基因去除。构建能去除选择标记基因的方法目前有共转化系统法、转座子系统法、位点特异性重组系统法、重组酶系统法、外源基因清除技术及叶绿体转化技术等，下面对这些方法及其优缺点进行简要介绍［1-4］。

1 标记基因去除方法

1.1 共转化系统法

最早研究的去除转基因植物中选择性标记基因的方法是共转化法。共转化法指的是两个质粒上分别插入标记基因和目的基因，或将标记基因和目的基因组装在一个质粒的两个不同的T-DNA区段上，同时进行转化。T-DNA插入是随机进行的，因此，标记基因和目的基因可同时插入同一细胞不同的染色体上，经后代遗传重组使两个基因分离，获得只含有目的基因而无标记基因的转基因植株［5］。

目前最常见的两种转化方法是农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的共转化法。农杆菌介导的共转化法有3种，分别是一质粒一菌株法、二质粒一菌株法和二质粒二菌株法。现研究得较多的是一质粒一菌株法。共转化法已经成功运用于水稻、烟草、大麦和玉米等植物中。2013年，Kapusi等［2］利用共转化将同时携带选择标记基因和效应基因的后代中分离去除选择标记基因，同时还指出加倍单倍体技术可以广泛的应用于传统的大麦育种计划，它是一个有用且固定的转基因方法，同时除去不需要的选择性标记基因。Komari等［6］将gus基因和hpt基因运用共转化的方法转入水稻和烟草中，经后代分离之后，不含标记基因gus的转基因植株大于50%。Miller等［7］运用共转化的方法，对含双T-DNA超二元质粒载体进行实验操作，最后得出结论：运用共转化法能获得转化效率为93.4%的无标记基因。基因枪介导的共转化法是一个有效的方法，Romano等［8］通过基因枪介导的共转化法得到了无标记基因的转基因马铃薯。Shiva Prakash等［9］采用相同的方法，获得了大量单拷贝的无选择标记的转基因玉米。

共转化法的优点是：方法简单，易于操作。农杆菌介导的转化法整合的位点比较稳定且拷贝数较低，机理清楚，适用范围广，稳定性较好，整合后的外源基因变异较小，较容易产生非连锁位点等特点。基因枪介导的共转化法去除标记基因的同时，减少骨架序列整合，并且不受材料基因型的控制。运用共转化法去除转基因植物中的标记基因应用中注意问题有3个方面：后代植株通过自交或杂交出现分离、转化体系的转化效率较高、T-DNA整合到不连锁位点。共转化法不足有：（1）需要利用有性杂交，将目的基因与标记基因分离，从而限制了共转化法在无性繁殖植物及生殖时间较长的物种中的运用。（2）此种方法转化效率较低，工作量大，费时，限制了共转化系统在转基因植物中的应用。（3）农杆菌介导法的转化存在骨架系列整合及基因型限制的情况。（4）基因枪介导的共转化法存在沉默、遗传稳定及拷贝数多等问题。

1.2 转座子系统法

转座子是一段可移动的、可自我复制的DNA序列，其存在于染色体DNA中。转座子系统指的是将转座子与目的基因或者标记基因相连接，转座子在移动的过程中，将目的基因与标记基因分离，子代植株通过遗传的分离得到只带有目的基因的转基因植株。因此，利用转座子方法可培育无选择标记基因的转基因植物。Andrew等［10］运用转座子介导的再定位法，使目的基因再定位，从而获得无标记基因的植物。John等［11］运用同样的方法将选择性标记基因去除。目前，转座子系统法用于去除标记基因的研究主要是Ac/Ds转座系统，来源于玉米，是构建插入型突变体库的理想技术。该系统在油菜运用中处于起步阶段，在水稻和拟南芥中运用较为广泛［12］。Ac/Ds转座系统在拟南芥中活性较高，在配子期转座酶介导Ds的转座频率高达68%［13］。

与其他方法相比，Ac/Ds转座系统主要的优点是：转化体中不携带T-DNA及其他非冗余序列，能获得无标记转化植物，转位后再插入对目的基因的表达无影响。但转座子法仍有不利于广泛运用的缺点：不仅不能实现当下比较热门的多基因聚合，而且转座子法还不适于无性繁殖的作物。此外，大部分植物中存在大量不同效率的转座子，转座切除的不精确性、耗时费力，以及后代出现突变，导致转座的效率不如人意，使转座子方法的运用渐渐减少。

1.3 位点特异性重组系统法

与转座作用相比，位点特异性重组系统法在转基因植物标记基因去除过程中具有删除高效精确、转化周期短等特点，在近年来的转基因工程研究中被广泛运用。重组是既能把外源的基因整合到染色体上，又能把染色体上的外源基因去除的方法。位点特异性重组系统法是指在DNA专一性的位点间通过重组酶的作用而实现同源之间的双向交换。该方法由两个关键点组成，即识别位点和重组酶。重组酶可以催化由正向排列的两个识别位点之间的序列，从而将标记基因去除。位点特异性重组系统法包括：FLP/FRTS系统、 FLP/frt系统法和R/RS系统法、Cre/lox系统法和Gin/gix系统法等。目前，被广为接受及运用较多的是Cre/lox系统法。

1.3.1 FLP/FRTs系统和 FLP/frt系统法 去除转基因植物选择标记基因的方法中，来源于啤酒酵母的FLP/FRTs系统被最先利用。如今已被广泛运用于水稻、烟草及拟南芥等真核植物的研究，诱导基因去除、插入及置换［14］。

FLP/FRTs系统法是指FRTs序列之间的DNA片段被FLP重组酶催化并重组。2010年，Li等［15］利用FLP/FRTs系统去除乙酰乳酸合成酶选择标记基因，删除效率为40.7%。同年，Fladung等［16］运用同样的方法使转化再生植物成功的去除FLP和nptⅡ基因，其删除效率为65.2%。Cregg 等［17］证明了FRTs之间的Arg基因可被酵母的FLP重组酶作用，他们将Arg+FRT结构引入Arg-酵母当中，并经过筛选得到了Arg+转化株，将FLP引入转化子中经过二次转化实验并又得到了Arg-转化子。此外，FLP/FRTs系统重组法在烟草中的同向定点重组位点frt之间的基因去除效率在19%-47%之间。FLP/frt重组系统中FLP重组酶能够催化同一分子当中的两个同向之间的位点，并去除DNA片段。重组功能已经在烟草、玉米细胞等实验中得以验证。单晓呋等［4］利用多个步骤的重组，建立了能广泛运用于植物当中的FLP/frt重组系统，通过二次转化的方法将两者先后转入烟草中并热激处理，引发重组反应，结果显示选择标记基因als有41%被有效去除。FLP/FRTs系统法的删除精确性较高，但因二次转化需建立一个高效的遗传再生体系，转化效率较低，大大限制了二次转化的运用。此外，有性杂交方法不适用于无性繁殖的植物，其工作量较大、周期长、不受人为控制等限制其在转基因植物中的运用。

1.3.2 R/RS系统 R/RS系统法源于接合酵母的SR1质粒，能专一识别特有的RS识别序列的重组酶，并使两个相邻的RS之间的DNA片段去除。2011年，Khan等［18］采用R/RS系统法得到了不含有ipt选择性标记基因的转基因番茄。Saelim 等［19］运用R/RS系统法对木薯处理转化，无选择标记基因的木薯占到88%-96%。Sugita等［20］通过R/RS系统与 MAT载体系统结合，明显提高了无选择标记的转基因植物（MFTPs）的产生频率。

与共转化法需要利用有性杂交相比，MAT载体系统具有无需有性杂交过程就可将选择性标记基因去除等优点，从而获得MFTP。这种方法可用于无性繁殖植物，使对某些植物进行多次转化变为现实。R/RS系统法与FLP/FRTs系统法相比，其优点：标记基因在去除过程中无需二次转化，适合无性繁殖的植物。其缺点：往往会在重组位点上留下一个识别的序列，使位点特异性重组系统法在受体植物中的多次运用受到限制。此外，如经历多次标记基因去除，可能存在多拷贝的识别序列导致基因沉默。

1.3.3 Cre/lox 系统 Cre/lox系统是目前运用最广泛、研究最深入的位点特异性重组系统法［21］。Cre/lox系统来自大肠杆菌噬菌体P1，于1981年被首次发现，因间隔区的非对称使lox 位点具有方向性。根据两个lox 位点的方向不同，其作用方式有3种：一是当两个 lox 位点不位于同一分子上时，将会导致DNA片段发生易位；二是当两个lox位点的作用方向相反时，重组反应会使lox位点间的DNA片段倒位；三是当两个位点的作用方向相同时，重组反应会使lox 位点间的 DNA片段去除。因此，在两个相同方向的34 bp大小的lox序列之间被Cre重组酶催化使重组发生，能使lox序列间的基因片段切除。Zuo等［22］将Cre/lox系统与化学诱导植物的表达系统（即XVE系统）相结合，形成另一种标记基因去除系统CLX系统（Cre/loxP DNA excision system），结果显示：CLX对受体植物的标记基因，包括重组酶基因cre、标记基因npt II、XVE，经β-雌二醇诱导后切除的效率达到了100%。此方法的优点：能运用于无性繁殖的植物中，精确的控制切除时间，不依赖ipt表型而进行筛选，以及通过构建合适的载体可以再生无标记基因的单拷贝植物。这是转基因植物工程中的一种较为理想化的方法。

有研究报告显示：Cre/lox重组法使用pX6载体进行筛选，结束之后雌二醇诱导Cre操纵子，合成切割重组，该重组是由 Cre蛋白介导lox位点，运用Cre/lox系统法能将标记基因去除［23］。郭霞等［24］运用了loxP位点识别系统，该系统能定向去除潮霉素抗性标记基因，他们运用农杆菌介导法将Bt抗虫基因成功的导入“晚粳97”（安徽主栽水稻品种）中，获得的loxp-hpt-loxp-Bt转基因水稻植株可以与带有Cre基因的水稻进行杂交，从而去除了潮霉素抗性选择标记基因。2011年，Khattri等［25］将大豆热休克启动子控制Cre基因导入水稻基因组，Cre介导的重组能够去除标记基因。芦春斌等［26］将番茄的Marker-Free系统进行转化，同时表达HPV16目的基因、E6、E7，转化之后可以将标记基因去除。同年，尚玉花等［27］利用该系统方法将转Bt基因水稻中的选择性标记基因去除。2012年，Chong-Perez等［28］利用Cre-lox位点特异性重组系统，热休克诱导转基因香蕉，将可选择的标记基因去除。这是第一次报告对香蕉有效去除标记基因的系统。

Cre/lox系统法因其精确性及可预知性使人们能够对基因进行定向、定点操作，成为转基因植物研究产品商业化的有效工具。运用该系统需注意的问题：Cre基因的高度表达，可能会使基因重排；可能含有一部分假的、潜在的lox 位点，与野生型位点有部分的同一性，在野生型重组的介导下能表现出活力；去除不彻底导致产生嵌合体的现象。

1.3.4 Gin/gix系统 Gin/gix系统法是指在两个Gix特异位点之间，在重组酶Gin作用下切除的全过程，是1991年由Maseser等［29］发现的。Gin/gix系统法的缺点是对植物的再生造成负面的影响，植物的应用中相关文献鲜见报道。

1.4 重组酶系统

自从重组酶系统Cre/loxp在烟草植物中转化成功以来，科学家们已尝试将重组酶系统运用到玉米、水稻和大麦等多种植物当中［30］。重组酶系统法指的是一种针对转入基因进行的组织特异性及定点操作的一种基因重组系统法，重组酶系统能够有效的进行基因整合性删除、染色体易位及条件性重组等。因此，可以将重组酶系统运用在转基因植物领域。2013年，Zou等［31］从根癌农杆菌构建异戊烯基基因（IPT）的选择标记基因和两侧由两个loxP位点直接定位的Cre重组酶基因，一种新的基于Cre/loxP位点重组系统从转基因柑橘中去除选择性标记基因。分析表明，在转基因植物中观察到100%的删除效率。这种方法提供了从转基因柑橘中生产无选择标记转基因植物的一种可靠策略。同年，García-Almodóvar等［32］构建（px6-dao1）化学诱导的Cre-loxP系统和选择的标记基因dao1来获得无标记转基因烟草。运用Cre/loxp重组酶系统具有时间和空间特异性、高效性、准确性及快速性等特点，因此拥有的重组方式可以去除特定基因［30］。但重组酶系统技术存在不足，要获得完整的重组酶系统需要二次转化或杂交等，耗时较长。此外，R/RS重组酶也可用于转基因植物中。2014年，Righetti等［33］用化学诱导的R/RS重组酶将转基因苹果和梨的nptII标记基因去除。

噬菌体phiC31位点重组酶系统是继FLP/frt重组酶系统和Cre/lox重组酶系统后又一新型位点的重组酶系统，在真核和原核生物中广泛应用。phiC31位点重组酶系统已在多种植物中得到验证。在植物中应用注意可能会出现去除不彻底的问题，可能与植物中相应的phiC31重组酶表达量太低有关。phiC31重组酶系统与其他类型的重组系统相结合，能够实现农作物外源基因的精确调控，将会是未来的重点研究方向之一［34］。

近年来开展了由重组酶介导的盒式交换重复基因打靶（RMCE）的研究，它是高可预测性以及基因表达重复性的一种有效工具，用于基因的功能和调控研究［35］。已经开发了定点整合（SDI）载体系统用于农杆菌介导的转化，SDI在没有任何共表达的选择标记基因条件下，精确地整合目的基因的单一拷贝到一个特定的染色体位点上，通过随机整合拷贝的去除，可以有效地增加RMCE，针对性地选择无标记的转基因植物。

1.5 两种重组系统的运用

1.5.1 外源基因清除技术 外源基因清除技术（Gene deletor）是美国康涅狄格大学华裔教授率先发展起来，为解决转基因植物安全性问题的有效工具。外源基因清除技术［36］指的是在基因进行转化的表达载体系统中引入酵母的重组酶系统与细菌的噬菌体（即构建Cre/LoxP和FLP/FRT双重组系统），在转基因植物中特异性的表达，由特异的启动子驱动FLP/Cre的重组酶基因，根据研究的目标可以将局部或整体的转基因植物的所有目的基因去除。不管是共转化法、转座子法，还是位点特异性重组系统法等等，仍然可能存在植物中的外源目的基因通过花粉逃逸在周围其他的物种中，引发的安全性问题仍然存在。与其他方法相比，外源基因清除技术可以去除转基因植物中几乎所有的标记基因和目的基因。此外，外源基因清除技术可同时运用于有性和无性的繁殖中，解决了R/RS系统法只适合于无性繁殖植物的局限性问题，也解决了FLP/FRTs系统法去除选择性标记基因效率较低的问题。但是外源基因清除技术存在不足，在特异的启动子驱动FLP/Cre的重组酶基因去除外源基因的同时，基因组中仍有一段序列存留。虽然影响不大，但是仍有待完善。

1.5.2 其他技术 2011年，邹璐琳等［37］同时运用了Cre/Lox系统和FLP/frt系统的两种重组系统方法培育了去除选择性标记基因的耐寒转基因植物，该方法成功构建了一个能够高效去除选择性标记基因的Bhlea2基因植物表达载体。2012年，Nandy等［38］运用FLPe/frt系统的位点特异性基因进行整合，去除水稻中的标记基因。该方法解决了外源基因随花粉漂移的问题，同时为食用组织部分去除目的基因提供了有效的方法。但是，目的基因的去除不利于转基因植物留种，并且需要分离受体植物种子或花粉的特异性启动子。因此，该方法在转基因植物研究及商业化运用方面受到一定的限制。

通过异源位点特异性重组酶（Site-specific recombinase，SSR）系统介导的转基因整合，已在几种不同的植物物种中得以证实。植物转化的方法产生一个精确的定点整合（Site-specific integration，SSI）结构，由一个单拷贝的转基因构建。由于SSR系统是转基因位点去除标记基因的一种有效工具，较早前已被提出，分别由不同的重组系统介导。SSI线路中无选择标记基因的的第一代本身被开发出来，更重要的是后代从这些线路中派生，继承了无选择的标记基因的特性。这种方法适用于简化生产的无选择标记的SSI生产路线。

1.6 叶绿体转化技术

叶绿体是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的细胞器。叶绿体转化技术指的是将转基因插入到叶绿体的基因组中。叶绿体转化技术主要有3种策略：一是运用同源重组的方式将外源基因特异重组到叶绿体基因组中；二是运用叶绿体5'-UTR和3'-UTR区序列、特异性启动子及终止子，使目的基因能在叶绿体高表达［39］；三是筛选标记基因使外源基因能在叶绿体基因中实现同质化［40］。因母系遗传是大多数植物叶绿体的遗传方式，当外源基因整合到叶绿体基因组，极少会出现外源基因随着花粉转移扩散到周围的环境中，可以解决标记基因传播到野生亲缘品种中导致杂草获得此抗性的危险。此外，目的基因表达有叶片组织的特异性，所以几乎不会在转基因植物的果实中大量累积。叶绿体转化技术适合于原核和真核植物基因的表达、外源基因高效表达，可进行多基因转化，不易产生基因沉默。因此，叶绿体转化技术在转基因植物的应用具有广阔的前景。1988年，人类首次成功运用叶绿体DNA转化衣藻突变体。2011年，Day等［41］报道了在广泛的植物种类中，叶绿体转化技术被证实是可行的，高效的标记基因去除方法是质体工程之中的一大亮点。但目前仍有一些问题尚未完全解决：一是细胞核与叶绿体间的基因流动问题；二是叶绿体DNA稳定性问题。

2 展望

为解决全球不断增长的粮食需求、保障经济可持续的发展，转基因植物商业化种植的环境安全以及食用安全仍会继续成为当今的焦点。研究者探索了不同的技术策略来保障转基因植物的安全性，出现多种多样的去除转基因植物中的选择性标记基因的方法，为确保安全高效的去除标记基因的技术具有重要的意义。以上所述的转基因植物标记基因去除方法中，共转化系统法运用最早，方法较为成熟，操作简单，运用较为广泛。位点特异性重组系统法因其定点删除、重组频率高等特点，展现出广阔的运用前景。去除标记基因技术仍在不断完善和改进当中。选择何种方法应根据不同植物的特性以及各方法的优缺点综合考虑。现代基因工程技术的不断发展为解决转基因植物的安全性问题带来了新的解决思路，研究者可以尝试运用多种系统方法联合使用的形式来进行研究。转基因植物中，随机插入可能会引起负面效应，内源基因突变及基因沉默是研究者需要关注以及有待解决的关键。当今转基因植物的食用安全问题和环境安全问题仍是该研究领域有待解决的瓶颈问题。要善于运用发散思维、勇于创新，以达到更为简单、高效和安全性更好的转基因植物中选择性标记基因去除方法的目标，为实现转基因植物安全性的进一步研究提供广阔的平台。总之，转基因植物中标记基因的去除方法广泛运用于农业、医疗卫生等行业大有潜能，我们也坚信用其方法能为人类健康事业谋福利。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on Methods of Removing Marker Genes in Transgenic Plants

Lang Yaoling1，2Guan Xiaoyan1，2Bai Guohui2Liu Jianguo1，2
（1. School of Stomatology，Zunyi Medical University，Zunyi563000； 2. Special Key Laboratory of Oral Diseases Research，Institutions of Higher Education in Guizhou Province，Zunyi563000）

With more and more varieties of transgenic plants emerging， environmental and food safety from using transgenic plants have been attracting extensive public attentions. One of the current problems is that the selectable marker genes， usually having the antibiotic or herbicide resistance， remain in transgenic plants. In order to improve the safety of using transgenic plants， removing marker genes from transgenic plants is not only conducive to the multiple using the same transgenic plants， but also more likely to allow the transgenic plants accepted by people. The current methods of removing marker genes in transgenic plants were reviewed， and the advantages and disadvantages of each method were compared from all aspects， which have a guiding significance for selecting a proper method in this field.

transgenic plants；selectable marker genes；safety

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.007

2014-08-18

国家自然科学基金项目（81260164），贵州省第六批科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队［2013］4026号），贵州省高等学校重点学科建设项目（SZXK-201207-04），贵州省高等学校特色重点实验室建设项目（黔教合KY字［2013］109号）

郎遥玲，女，硕士研究生，住院医师，研究方向：龋病的免疫学防治；E-mail：296733308@qq.com

刘建国，男，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：龋病、牙周病病因和免疫学防治、氟斑牙发病机制、牙颌畸形矫治的基础与临床；E-mail：13087891001@163.com