贝类毒素检测方法研究概况

李芳，李雪梅，李献刚，于凤娇，陈莹，孙沛（国家级农兽药残留及海洋生物毒素检测重点实验室，东港出入境检验检疫局，辽宁东港118300）

贝类毒素检测方法研究概况

李芳，李雪梅，李献刚，于凤娇，陈莹，孙沛
（国家级农兽药残留及海洋生物毒素检测重点实验室，东港出入境检验检疫局，辽宁东港118300）

摘要：主要针对腹泻性贝毒（DSP）、麻痹性贝毒（PSP）、神经性贝毒（NSP）、记忆缺损性贝毒（ASP）和蓝藻毒素5类主要贝类毒素，着重介绍分析检测方法和仪器分析技术，同时介绍这5类毒素的相关概况及限量要求。

关键词：贝类毒素；性质；检测方法；限量

贝类毒素的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关，属于海洋天然有机物，20世纪以来，赤潮在世界范围内频繁爆发，贝类通过滤食有毒微藻（主要是藻黄素），经过生物累积和放大转化为贝类毒素，水体的富营养化导致水体中藻类的过度繁殖，最终在贝类体内形成毒素进入到社会部分流通领域，依据赤潮生物对其他生物的作用情况可将赤潮分为3类：（1）无毒赤潮；（2）对人无毒，但对鱼类及无脊椎动物有毒的赤潮；（3）有毒赤潮。在有毒赤潮中，赤潮毒素作用于人类消化系统、神经系统或心血管系统，引起中毒，威胁人类健康，这类赤潮最应引起重视。同时由于贝类毒素对人的危害已经被关注，对这些有害毒素的检测也逐渐受到各类专家的重视，本文着重介绍各类毒素的分析检测技术，同时介绍一些相关性质及限量要求，展望对贝类毒素检测手段，检测种类。

1　贝类毒素性质

1.1腹泻性贝毒（DSP）

腹泻性贝毒是由甲藻产生的，属于鳍藻属和原甲藻属[1]，可引起人类腹泻、恶心、呕吐等症状，是从各种贝类和甲藻中分离出来的一类脂溶性物质，其化学结构为聚醚或大环内酯化合物。根据这些成分的碳骨架结构可以将它们分成酸性成分、中性成分和其他成分3种。目前发现的腹泻性贝毒约有12种，其中9种结构已经确定，分为中大田软海绵酸（OA）及其衍生物鳍藻毒素（DTX-3）；大环内酯贝毒素-（1 PTX-1）、PTX-2、PTX-3、PTX-6；磺化毒物、紫夷贝毒素（YTX）及其衍生物三大类。毒性机制主要在于其活性成分OA能够抑制细胞质中磷酸酶的活性，导致蛋白质过磷酸化，从而对生物的多种生理功能造成影响。欧盟（EU）对在市场流通的鲜活贝类及贝类产品要求腹泻性贝毒在整体数量上含有的海洋生物毒素（以整体或各个可食用部分来计量），采用生物法（BTM）分析时，不能为阳性结果，或以大田软海绵酸、鳍藻毒素和扇贝毒素一起计算，大田软海绵酸等价物≤160 μg/kg。食品和药物管理局（FDA）规定最大检出量为0.2 mg/kg。

1.2麻痹性贝毒（PSP）

麻痹性贝毒已经成为世界上分布最广，事故发生频率最高，危害程度最大的一类毒素[2]。麻痹性贝类毒素主要来源于藻类，也有人提出贝类毒素源于细菌。其毒性很强，相当于河豚毒素的毒性。目前已分离出20种麻痹性贝类毒素，分为石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neo-STX）、膝沟藻毒素（GTX）3大类。麻痹性贝毒是一类神经性毒素，为二代盐，分子量低，白色，极性比较高，不挥发，易溶于水、微溶于甲醇和乙醇，不溶于非极性溶剂。在酸性条件下稳定，在碱性条件下可发生氧化，导致毒性降低甚至消失。遇热稳定，不能被人体中的消化酶所破坏[3]。麻痹性贝类毒素是细胞膜钠离子通道高度专一性阻滞剂，可阻滞神经细胞的兴奋和传导，使人中毒的范围在600 Mu～5 000 Mu之间（Mu为毒力单位，1 Mu是指使18～229的小白鼠在15 min内死亡的毒力），致死剂量为3000Mu～30000Mu。可使中毒者在24 h内肌肉麻痹、呼吸困难、缺氧昏迷甚至窒息而死亡。目前尚无麻痹性贝类毒素特效药，所以只能利用各种检测手段，阻断毒素对人类安全造成的危害。欧盟对在市场流通的鲜活贝类及贝类产品要求麻痹性贝毒在整体数量上含有的海洋生物毒素（以整体或各个可食用部分来计量）不得超过80 μg/ 100 g石房毒素等价物。

1.3神经性贝毒（NSP）

神经性毒素的毒性相对较小，这类毒素属于含有脂溶性的多醚化合物，不含氮，是一种去极化物质。它可以打开细胞膜上电压门控的钠离子通道，尤其在细胞膜内电位处于超极化状态时，使钠离子不可控地大量内流，从而使细胞膜持续处于去极化状态，进而引起平滑肌的持续收缩[4-5]。神经性贝毒是唯一一类可以通过吸入导致中毒。人误食含有神经性贝毒的食物时，主要症状是神经麻痹。其潜伏期较短，一般为数分钟至数小时，中毒者主要表现为唇、舌头、喉头及面部有麻木感与刺痛感、肌肉疼痛、头晕等神经性症状及某些消化道症状。疾病持续的时间一般为几天，很少出现死亡情况[6]。目前，对新鲜的、冷冻的或罐装制品的牡蛎、蛤类和贻贝的神经性贝类毒素最大允许限量为20 Mu/100 g。

1.4记忆缺失性贝毒（ASP）

软骨藻酸能够竞争性结合氨基酸受体，引起中枢神经系统海马区和丘脑区以及记忆有关区域的损伤，导致记忆丧失。记忆缺失性贝毒的主要毒素成分为软骨酸藻（Domoic acid，DA），它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸，由长链羽状硅藻代谢产生的一种物质。欧盟和国家安全标准为20 mg/kg贝肉组织。

1.5蓝藻毒素

蓝藻毒素是由水体中蓝绿藻产生的一类具有生物活性的单环七肽化合物，此类毒素易溶于水，甲醇或丙酮，不挥发，抗pH变化溶于水，化学性质相当稳定，在水中降解十分缓慢，且耐高温，不挥发，耐酸碱，它是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂。微囊藻毒素是蓝藻产生的一类天然毒素，目前认为蓝藻毒素暴露的途径主要包括：皮肤接触、呼吸道吸入、血液透析和消化道摄入，实际上这些途径可能同时发生[7]。世界卫生组织推荐的限量为每升1 μg。

2　检测方法

2.1小鼠分析法

小鼠分析法是应用最多的贝类毒素检测方法，此方法对于检测腹泻性贝毒、麻痹性贝毒、神经性贝毒、记忆缺损性贝毒和蓝藻毒素都可以采用，是生物学检测的主要采用的方法。这种方法已经被美国分析化学家协会（Association of American Analytical Chemists，AOAC）确定为对PSP的标准检测程序，以鼠单位（Mouse unit，Mu）表示，其检测限为4 Mu/g，另有DSP的检测限为0.05 Mu/g，但是这种方法对各种藻毒素的检测还没有统一[8]的认识和标准。此方法是针对毒素的功能，而不是毒素的结构，所以只能检测毒素的有无及大小，不能判断是何种毒素，以及准确的含量，同时该方法的不确定性非常多，操作过程相对复杂，试验结果重复性差，测试所需时间较长。

2.2酶联免疫法

酶联免疫法是利用抗原与抗体反应，微孔板包被有针对各类毒素抗体的捕捉抗体，加入酶标记物，游离的酶标记物竞争毒素抗体，同时毒素抗体与捕捉抗体连接，取出多余的酶标记物，将底物和发色剂加入到孔板中孵育显色，通过对特定吸收波长的吸收强度比对，对毒素进行定性定量的检测。此方法具有专一性强、使用方便、检测时间短等优点。目前，已经有多种针对大田软海绵酸、膝沟藻毒素等贝类毒素检测的商品化试剂盒。酶联免疫法测试的检出限相对较低，其检测毒素的检出低限可至pg/g级，如腹泻性贝类毒素（冈田酸）水样检测限为0.05 ng/mL，贝类样品检测限为0.1 ng/g；麻痹性贝类毒素检测限为0.02 ng/g；神经性贝类毒素检测限为0.01 ng/g；记忆缺失性贝类毒素（软骨藻酸）检测限为0.5 ng/g；蓝藻毒素（微囊藻毒素）检测限为0.1 ng/g。但由于贝类毒素种类繁多，目前的商品化试剂盒检测贝类毒素种类较少，对很多贝类毒素缺乏有效的免疫监测手段，免疫检测只能根据待测物结构表位进行测定，而非针对其结构，因此其类似物有干扰作用，会出现假阳性或对毒性估计的不准确，同时试剂盒价格昂贵，不利于大规模推广使用。

2.3高效液相色谱-荧光检测法

高效液相色谱-荧光检测法方法是目前国内外检测腹泻性贝毒和麻痹性贝毒的常用方法，其主要原理是利用合适的溶剂提取样品中的待测物质，去除样品中一并提取出的杂质，加入衍生化试剂，通过衍生作用使待测化合物在一定波长的激发光照射下能够产生荧光，利用荧光强度计算含量，从而进一步进行定性、定量研究。几乎所有的贝类毒素都能使用高效液相色谱-荧光检测法进行检测，检测时间较生物检测法短，配合液相色谱系统的自动进样器能够完成大批样品的检测任务，对于麻痹性贝类毒素利用高效液相色谱-荧光检测方法，其检测低限一般在6.5 μg/kg～129 μg/kg，完全可以满足限量要求。不过高效液相色谱-荧光检测法对于结构相似，保留时间基本相同的同系贝类毒素定性能力较差，分析使用的衍生化试剂较昂贵，有些荧光化试剂不稳定，需要现用现配。

2.4毛细电泳法

毛细管电泳法，还不是常规水体检测藻类毒素的技术。具有柱上富集作用，分析速度快，效率高，已实现自动化等优点。但是相对比较此方法灵敏度不够高，为1 mg/L。也有报道衍生藻毒素为荧光化合物，应用激光诱导荧光监测器可提高灵敏度，但此法还不成熟。此方法经过不断地改善，有望成为操作简单，快速的各种贝类毒素常规检测方法。

2.5高效液相色谱串联质谱法

高效液相色谱串联质谱法已经被广泛应用于贝类毒素检测工作中，此方法具有检出限低、稳定性好、抗干扰能力强、定性定量结果准确，由于贝类毒素已经有商业化的标准品，所以对贝类毒素的检测方法也已经向液相色谱-串联质谱法发展，目前，国内外对于使用该方法检测贝类毒素含量的报道越来越多，也有利用该方法针对某一种贝类毒素进行检测的行业标准，对于记忆缺失性贝毒利用该方法检测的检出限为100 μg/kg，但是该方法还没有形成一套完整的针对多种贝类毒素检测的标准方法。虽然此方法可以准确的定性、定量，不过得以实施的基础是分离纯化的贝类毒素标准品，由于现有标准品种类有限，所以该方法也有一定的局限性。

2.6其他方法

除了上述5种主要方法，对于贝类毒素的检测方法还包括薄层色谱法，气相色谱法，气相色谱串联质谱法，高效液相色谱-紫外检测器等相关方法，同时酶活性抑制检测技术、生物传感器检测技术、分子探针技术、荧光原位杂交技术、重组质粒技术等也在贝类毒素检测的过程中发挥着越来越重要的作用。

3　结语

近二十年来，人们发现了贝类毒素的存在与危害，重视赤潮给海洋带来的污染，同时也不断想办法研究对其检测方法，以及解决方法，随着研究的深入，会有愈来愈多的贝类毒素被发现，检测方法越来越完善，越来越统一，并且向着定性、定量快速准确、低成本，高自动化的方向发展。

参考文献：

[1]赵晓芳,计融.腹泻性贝类毒素研究进展[J].中国热带医学,2006,6 (1):157-159

[2]Chang F H,Kulis D M,Till D G,et al.Toxin production of Alexandrium minutum(Dinophyccae)from the Bay of Plenty,New Zealand [J].Toxicon,1997(35):393-409

[3]崔伟民,杨维东,刘洁生.双壳贝类麻痹性贝毒抗性机制的研究[J].卫生研究,2008,37(3):377-380

[4]WATANABE T,LOCKEY R F,KRANOWSKI J J.Airway smooth muscle contraction induced by ptychodiscus brevis(Red tide)Toxin as relates to a trigger mechanism of bronchial asthma[J].Immuno Allergy Pract,1988,10(5):185-193

[5]NOZAWA A,TSUJI K,ISHIDA H.Implication of brevetoxin Bl and PtTx-3 in neurotoxic shellfish poisoning in New Zealand by isolation and quantitative determination with liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].Toxicon,2003,42(1):91-103

[6]杜伟,陆斗定.有毒赤潮藻及其毒素的危害与检测[J].海洋学研究,2008,26(2):89-97

[7]陈艳,俞顺章,王金秋.蓝藻毒素的毒性及其生物富集、暴露途径和危险度评估[J].上海环境科学,2002,21(6):361-364

[8]ANDERSON D M,ANDERSON P,BRICELJ V M,et al.Monitoring and Management Strategies for Harmful Algal Blooms in Coastal Water[G].Paris:[s.n],2001:31-40

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.048

收稿日期：2014-06-25

作者简介：李芳（1984—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：分析检测。

Research on Progress of Determination of Shellfish Toxin

LI Fang，LI Xue-mei，LI Xian-gang，YU Feng-jiao，CHEN Ying，SUN Pei
（National Level Key Laboratory of Veterinary Drug，Pesticid Residue＆Marine Life's Toxin Detection，Donggang Entry-Exit Inspection＆Quarantine Bureau，Donggang 118300，Liaoning，China）

Abstract：This article mainly aims at five kinds of shellfish toxins，including diarrhea shellfish poisoning （DSP），paralytic shellfish poisoning（PSP），neurotoxic shellfish poisoning（NSP），amnesic shellfish poisoning （ASP）and cyanophyta toxin，introduced emphatically analytical method，instrument analysis technology，the general situation and the limited requirements of them.

Key words：shellfish poisoning；characteristic；analytical method；limited