Bcl-2与卵巢颗粒细胞凋亡相关性研究

蔺会兰　孙晓慧　刘俊霞　金立娟　田硕　张艺玮　杨尊会　镡丽霞

作者单位: 050011河北省石家庄市第一医院

Bcl-2与卵巢颗粒细胞凋亡相关性研究

蔺会兰孙晓慧刘俊霞金立娟田硕张艺玮杨尊会镡丽霞

作者单位: 050011河北省石家庄市第一医院

【摘要】目的比较卵巢功能减退患者和卵巢功能正常女性颗粒细胞凋亡及Bcl-2表达情况，探讨卵巢功能减退的发病机制。方法选择接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的不孕患者48例，其中卵巢功能减退患者23例，卵巢功能正常对照患者25例。于取卵日收集卵泡液，离心收集颗粒细胞培养，用TUNEL检测颗粒细胞凋亡情况。免疫组化分析颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达情况。结果卵巢功能减退组和卵巢功能正常组颗粒细胞凋亡率分别为(27 ±13) %、(18±8) %，卵巢功能减退组颗粒细胞凋亡率较对照组增高(P<0.05) ;免疫组化分析显示Bcl-2主要在颗粒细胞胞浆中表达，卵巢功能减退组Bcl-2蛋白表达较正常对照组下调(P<0.05)。结论Bcl-2可能通过调节颗粒细胞凋亡情况，影响卵泡发育及卵巢的功能。

【关键词】颗粒细胞;凋亡; Bcl-2;卵巢功能

项目来源:石家庄市科学技术研究与发展指导计划项目(编号: 131462553)

E-mail: linhl2011bs@163.com

近年来由于社会性、医源性和自身因素的影响，卵巢功能减退发病率越来越高。寻找卵巢功能减退的发病机制对改善卵巢功能至关重要。卵泡由1个居于核心的卵母细胞及周围的颗粒细胞和卵泡膜细胞组成。在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化对卵母细胞的发育成熟起重要作用。颗粒细胞凋亡与卵子闭锁及卵巢功能减退关系密切［1］。有学者认为当颗粒细胞凋亡达10%以上时该卵泡发生闭锁，从而影响卵巢功能［2］。本研究通过比较卵巢功能减退患者和正常女性颗粒细胞凋亡及Bcl-2表达情况，探讨卵巢功能减退的发病机制。

1　资料与方法

1.1一般资料选择我院2012年10月至2013年10月接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET/ICSI)治疗的不孕患者48例。纳入标准:年龄25～40岁，月经周期25～35 d，B超检查除外卵巢多囊改变、子宫肌瘤、子宫内膜异位症声像改变，除外发热及炎症疾病，除外甲状腺疾病、肾上腺疾病及其他系统肿瘤等。患者签署知情同意书。根据基础FSH值和卵巢基础窦卵泡数分为卵巢功能正常对照组(FSH＜8 U/L且窦卵泡数＞5 枚) 25例和卵巢功能减退组(FSH＞10 U/L或窦卵泡数＜5枚) 23例。

1.2控制性超促排卵方案卵巢功能正常患者采用常规长方案超促排卵。于前1个月经周期B超监测排卵，排卵后7 d(月经第21～23天)开始每天皮下注射GnRH激动剂曲普瑞林(博福益普生制药生产) 0.05～0.1 mg，14 d后根据患者的年龄、AFC及基础血清FSH、LH、E2水平确定促性腺激素，采用重组人促卵泡素(商品名果纳芬，默克雪兰诺公司)和尿促性激素(HMG，丽珠制药有限公司)剂量。阴道B超开始监测卵泡大小，根据卵泡发育情况，调整用量剂量直至注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)日止;卵巢功能减退患者采用短方案促排卵，在超促排卵前即月经第2天B超下进行窦卵泡计数、有无卵巢囊肿，给予GnRH激动剂曲普瑞林0.1 mg，1次/d，月经的第3天给予促排卵药物，阴道B超开始监测卵泡大小，直至HCG日止当1个主导卵泡平均直径超过18 mm、2个主导卵泡平均直径超过17 mm、3个主导卵泡平均直径超过16 mm时给予人绒毛膜促性腺激素(HCG) 5 000或10 000 U肌内注射，36 h后经阴道超声取卵。取卵后第3天超声引导下行胚胎移植。

1.3颗粒细胞凋亡检测取卵后，显微镜下小心剥离卵母细胞，剩余卵泡液收集于无菌试管中，2 500 r/mi离心10 min，弃上清，收集颗粒细胞用TUNEL方法进行染色:将颗粒细胞涂片用10%福尔马林磷酸盐缓冲液固定30 min后PBS冲洗，放入0.3%H2O2中1 h，加入0.1% TritonX-100，4℃反应2 min，加入Tunel反应混合物37℃湿盒中反应1 h，加入DAB显色，苏木素复染，光学显微镜观察细胞凋亡情况并计数凋亡细胞百分比。凋亡阳性细胞在光镜下呈棕黄色，正常细胞无着色。显微镜下任意选取视野，共计数500个细胞计算凋亡率(凋亡率=凋亡阳性的细胞数/细胞总数×100%)。

1.4免疫组化法检测颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达吸取上层颗粒细胞放于PBS溶液中，1 000 r/min×10 min离心;弃上清，用1～2 ml的PBS重悬颗粒细胞，过300目细胞筛，即获取颗粒细胞的单细胞悬液，取颗粒细胞的单细胞悬液1 ml，用6 ml含有10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，PBS漂洗两遍后，1% Triton-100室温孵育30 min破膜; PBS漂洗3遍后，滴加3% H2O2。室温孵育30 min; PBS漂洗3遍后，滴加封闭液，室温孵育20 min;移除封闭液后，滴加Ⅰ抗(1∶100) 4℃过夜; PBS漂洗3遍后滴加Ⅱ抗37℃25 min; PBS漂洗3遍后滴加SABC20，37℃20 min，再用PBS漂洗DAB显色;最后用苏木精复染细胞核，用1%盐酸酒精分化，用1%氨水返蓝，再经过乙醇梯度脱水、松节油透明后即可封片、镜下观察和采集图像。

1.5统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.12组临床资料比较卵巢功能减退组和卵巢功能正常组患者年龄、促黄体生成素(LH)、睾酮比较差异无统计学意义(P＞0.05) ;卵巢功能减退组和卵巢功能正常组患者FSH、E2、窦卵泡数比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　2组临床资料比较　±s

表1　2组临床资料比较　±s

注:与卵巢功能正常组比较，*P＜0.05

指标　卵巢功能减退组(n=23)　卵巢功能正常组(n=25)年龄(岁)33.24±4.62　30.82±4.12体重指数(kg/m2)　21.54±9.72　20.68±9.35不孕年限(年)　4.21±2.17　3.83±1.76 FSH(U/L)　11.48±1.06*　6.28±0.92 LH(U/L)　5.44±1.94　4.55±1.03 E2(pmol/ml)　215.49±57.38*　189.75±71.06 T(pmol/ml)　1.07±0.66　1.18±0.58窦卵泡数(枚)　6.53±1.88*14.34±3.29

2.22组颗粒细胞凋亡率比较卵巢功能减退组颗粒细胞凋亡率为(27±13) %高于卵巢功能正常组的(18±8) %，差异有统计学意义(P<0.05)，TUNEL染色卵巢功能减退组颗粒细胞表现为棕黄色，正常组无着色。

2.3免疫细胞化学检测bcl-2蛋白的表达卵巢功能减退患者颗粒细胞阳性细胞数低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。颗粒细胞着色深度低于正常对照组。见图1。

3　讨论

图1　免疫细胞化学检测bcl-2蛋白表达(DAB显色×400)

卵巢功能减退是妇科常见疾病之一，近年发病率呈上升趋势。引起卵巢功能减退的原因可能有遗传性、免疫性、医源性、代谢性因素，环境污染、毒物接触及吸烟、抑郁和未产妇长期月经紊乱等，其临床表现主要以闭经、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高为特征，常伴有围绝经期综合征的症状，如潮热、多汗、情绪不稳定、性欲低下、阴道干涩等。处于生育期的女性提早闭经，在心理上会产生沉重包袱，影响婚姻生活质量，产生一系列心理和社会问题。卵巢功能减退的治疗方法包括:卵巢组织冷冻、激素替代、中医中药等［3］。

卵巢中卵泡发育由始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡到成熟卵泡，其中99%的卵泡在不同阶段闭锁。对发育卵泡而言，细胞凋亡的最终表现为卵泡闭锁，其中颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要直接原因。卵巢功能减退的主要原因就是卵巢颗粒细胞凋亡增加，卵泡闭锁加速，卵母细胞的凋亡［4］。颗粒细胞是卵泡表面包裹的一层壁细胞，其与卵母细胞间存在复杂的连接机制，在卵丘周围形成一个多层次的细胞网络，与卵泡进行物质交换及细胞间信号传导。颗粒细胞一方面运输营养物质给卵母细胞，另一方面与卵泡内膜细胞共同作用分泌激素、生长因子等多种物质，影响卵母细胞发育，影响卵巢功能［5］。此外，颗粒细胞贮存并释放的某些生长因子和特定蛋白质在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中按一定顺序表达并选择性地弥散来发挥调节胚胎发育的作用［6］。在卵泡周期性发育过程中，各个时期卵泡的闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关［7］。颗粒细胞凋亡增加可能影响卵母细胞的成熟，进一步影响受精和胚胎的发育潜能［8］。有研究［9］表明颗粒细胞的凋亡与卵母细胞核的成熟、受精有关。也有研究表明颗粒细胞凋亡增加可能会引起卵母细胞核成熟延迟，导致受精能力下降［10，11］。卵巢颗粒细胞凋亡是处在一个非常复杂内环境控制下完成的，并具有高度协调性，它不仅有下丘脑-垂体-卵巢轴调节作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的调控机制，也存在其他组织产生的影响细胞凋亡的物质的作用［12］。颗粒细胞凋亡受卵泡刺激素、黄体生成素、雌孕激素、生长因子及受体和细胞活素等因素影响。线粒体DNA缺失可能会使卵泡细胞凋亡加速而引起卵巢早衰［13］lee等［14］将鼠线粒体与卵巢颗粒细胞共同培养后发现，线粒体具有防止颗粒细胞凋亡的作用，但具体机制尚不十分清楚。本研究中卵巢功能减退患者颗粒细胞凋亡率明显高于卵巢功能正常者。

参与细胞凋亡调控的重要基因有多种，其中B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)家族对凋亡起决定作用的。Bcl-2家族位于胞质面的线粒体外膜、内质网膜和核膜上，已知的家族成员至少有15个，抑制凋亡发生的主要成员包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等。Bcl-2基因是一种细胞凋亡信号基因，其家族成员是细胞凋亡的关键性调节因素。Bcl-2蛋白可存在于免疫、神经、内分泌系统等正常组织中，亦存在于人卵巢组织中。有研究发现对鼠类卵巢颗粒细胞凋亡起决定性作用［15］。对只在卵细胞表达Bcl-2而在体细胞中无表达的小鼠研究发现卵细胞凋亡受抑制，这些小鼠窦前卵泡的闭锁明显少于野生型小鼠，说明Bcl-2有保护窦前卵泡的作用，其作用机制可能是抑制卵细胞凋亡［16］。研究表明Bcl-2不仅可以通过直接抑制卵细胞凋亡或促进始基卵泡数量增多等途径发挥其对卵泡的发育调节作用，其抗凋亡作用还可能通过卵泡内颗粒细胞发挥作用。卵巢颗粒细胞的凋亡通过线粒体途径介导bax表达，诱导细胞色素C从线粒体释放出来，继而激活Caspase-3、Caspase-9，引发Caspases级联反应，导致凋亡［17］。而Bcl-2通过抗氧化途径起到抑制凋亡的作用［18］。有研究表明Bcl-2可以防止线粒体内Ca2+与细胞色素C向外释放，降低细胞代谢过程的活性氧，抑制颗粒细胞的凋亡［19］。有研究发现卵巢颗粒细胞中特异表达Bcl-2的转基因鼠，排卵数明显高于对照组［20，21］。Bcl-2过表达可拮抗bax，抑制卵泡膜细胞及颗粒细胞的凋亡，促进其分泌雌、孕激素，进而控制卵母细胞凋亡，延缓卵泡闭锁，改善围绝经期综合征［22，23］。动物实验表明，当颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁时，在颗粒细胞内几乎检测不到凋亡抑制基因的表达产物Bcl-2蛋白［24］。另外Bcl-2亦可防止一些与凋亡有关的基因被激活并抑制这些基因表达产物的功能。本研究利用免疫组化技术检测颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达结果显示，Bcl-2蛋白主要在细胞浆着色，呈棕黄色。在卵巢功能减退患者的颗粒细胞中，Bcl-2阳性细胞数以及着色深度显著低于正常卵巢的颗粒细胞。推测Bcl-2可能参与卵巢颗粒细胞的凋亡过程，间接影响卵母细胞的凋亡，在卵巢早衰的发生和发展中起重要作用。尽管Bcl-2调节颗粒细胞凋亡的具体机制目前尚不十分清楚，但通过对Bcl-2基因的研究，并将其导入卵巢组织中，将会成为是治疗卵巢功能减退的一种新方法，也可为临床诊断确定分子靶点的研究提供参考依据。

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(收稿日期:2014－10－11

通讯作者:孙晓慧，050011河北省石家庄市第一医院;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.010

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1316－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 7111.75