口腔黏膜白斑凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达及意义

满一　钟良军　徐巍巍

作者单位: 065000河北省廊坊市，中国石油天然气集团公司中心医院口腔科(满一、徐巍巍) ;杭州师范大学医学院口腔医学系(钟良军)

口腔黏膜白斑凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达及意义

满一钟良军徐巍巍

作者单位: 065000河北省廊坊市，中国石油天然气集团公司中心医院口腔科(满一、徐巍巍) ;杭州师范大学医学院口腔医学系(钟良军)

【摘要】目的通过探讨凋亡相关蛋白在口腔白斑病变过程中细胞凋亡状况和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达的研究，探讨白斑发病机制及恶变机理。方法采用免疫组织化学检测法，与正常口腔粘膜对照，观察分析29例口腔白斑中Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。结果上皮异常增生各组的凋亡指数均高于正常，Bcl-2、Bax在上皮单纯增生、异常增生显过度表达，表达强度、分布也发生了改变。结论癌前病变中，上皮细胞凋亡状况发生了改变，Bcl-2可能对增生组织向恶变的转化发挥阶段性的促进作用，促凋亡因子Bax作用加强;凋亡因子的发挥即相互协同又相互制约。

【关键词】白斑;凋亡蛋白; Bcl-2; Bax

口腔黏膜白斑是最常见癌前病损，处于向恶性转化的不稳定状态，以不同程度的上皮增殖和不典型上皮增生为基本特征，在细胞异常增殖中，凋亡相关蛋白都有质与量的变化。为此，在正常口腔黏膜上皮向上皮异常增生转化的不同阶段，观察和探讨细胞凋亡生物学行为对上皮增殖影响，不仅有助于阐明恶变发生的机制，而且有利于临床上筛选高危人群和评估白斑的预后和治疗效果。

1　资料与方法

1.1一般资料选择中国石油天然气集团公司中心医院2009年7月至2012年12月经手术切除并经病理确诊的正常口腔黏膜25例，白斑29例，其中单纯上皮增生9例、轻度异常增生6例，中度轻度异常增生8例，重度异常增生6例。所有检材诊断和组织学分类均依据WHO标准，由两名经验丰富的病理学专家完成。

1.2试剂所有试剂均购至福州迈新生物技术有限公司。Bcl-2、Bax为即用型鼠抗人单克隆抗体，SP复合物MaxVisionTM为快捷即用型是通过聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠和抗兔IgG分子结合在多聚物上形成多聚物分子，使酶分子与二抗直接结合形成的多聚物分子高度敏感性染色强度增大，避免非特异性背景染色。DAB显色试剂盒为链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HPR)免疫组化染色Enivision系统，适用于链霉素-过氧化物酶免疫组织化学染色方法(streptavidin peroxidase，SP)。

1.3实验方法采用免疫组化链霉素抗生素-过氧化物酶免疫组织化学染色方法(streptavidin-peroxidase SP)法染色检测细胞凋亡与增值状况。所有组织切片经10%甲醛固定、常规脱蜡、透明、浸蜡、石蜡包埋5 μm连续切片，固定于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规组织切片脱蜡入水;微波加热10 min暴露抗原;过氧化物酶溶液阻断内源性过氧化物酶的活性PBS水冲洗，鼠抗人即用型Bcl-2和Bax抗体37℃孵育60 min，加入SP复合物HRP-MarVisionTM，30℃孵育60 min;加入SP复合物HPR，4℃过夜; DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原顺序加入、混匀成DAB显色液滴定组织切片，室温下显色10 min，显色后苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗为阴性对照，以组织内淋巴细胞阳性染色为Bcl-2的阳性对照，胃癌阳性染色切片为Bax的阳性对照(福州迈新生物技术公司提供)。

1.4结果判定采用HM2A8-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，每例每张切片各随机选取5个不重复、不重叠200和400倍高清视野，细胞质和细胞核染成棕色或棕红色颗粒或弥漫成片状为Bcl-2和Bax的阳性表达。计数切片中1 000个上皮基底细胞中的阳性细胞数。参照Hueber等［1］标准，将Bcl-2和Bax定级为: (1) bcl-2，未见阳性细胞着色为阴性(－) ;阳性细胞数＜10%为(+) ; 11%～25%为(++) ; 26%～50%为(+++) ;＞50%为(++++)。(2) Bax，阳性反应为棕色到棕红色颗粒或片状弥散定位于胞浆，高倍镜下计数:标本中无阳性细胞为0分，＜25%为1分; 26～50%为2分; 50%以上为3分，最后求其平均数。染色强度以棕色为1分;深棕色为2分;棕红色为3分。两者相乘，0分为阴性(－) ; 1～3分为弱阳性(+) ; 4～6分为中等阳性(++) ; 7～9分为(+++)。计算凋亡指数(apoptosis index，AI)=凋亡细胞数/视野内细胞总数(×200)×100%。

1.5统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，病变组织与对照组中阳性表达率以及各种临床指标中的表达率的的的差异采用χ2检验;样本数＜40，癌前病变Bcl-2、Bax阳性表达率之间的相关性，白斑与正常上皮之间的bcl-2、bax阳性表达率的差异采用Fisher精确概率法单因素相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1口腔白斑皮损组织Bcl-2蛋白免疫组化染色白斑各组的凋亡指数均高于正常口腔黏膜，并与鳞癌的凋亡指数接近［2］。在25例正常口腔黏膜中出现例Bcl-2阳性着色，主要分布在上皮基底及棘层。2例白斑中15例出现染色强度各异的阳性着色，阳性率51.72%，病变各组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，主要定位于细胞核周。另外，白斑各组中Bcl-2阳性细胞分布也发生改变，强阳性反应细胞大多集中于基底层与棘层深层，常见弥漫上皮全层的阳性染色，与内对照的阳性淋巴细胞相比，反应强度要弱，由基底向上皮表层过渡层染色强度不变，在病理分级中白斑各阶段阳性细胞表达率差异无统计学意义(P＞0.05)。Bcl-2在上皮细胞表达分布主要有两种形式:其一局灶型，以数个、数十个Bcl-2阳性细胞聚集成团状;其二弥散型，但染色强度未减弱，与内对照淋巴细胞相比，上皮细胞染色弱。见表1、2，图1～4。

表1　口腔正常黏膜、白斑、扁平苔藓上皮细胞凋亡指数(AI)比较

2.2口腔白斑皮损组织Bax蛋白免疫组化染色在25例正常口腔黏膜中出现10例Bax阳性着色，主要分布在角化层和粒层，点状散在型分布为主，表达程度较均一，为弱阳性反应。29例白斑中22例出现Ba阳性着色，阳性率75.86%，与正常组织相比，差异有统计学意义(P<0.05)。主要定位于细胞胞质中基底层以上到角化层均有表达，部分基底层也见阳性反应，棘层的染色最强，强阳性着色细胞遍布棘细胞全层与胞外基质。中等强度以上的染色达60%以上，随上皮异常增生程度的加剧，Bax的表达逐步增强，重度异常增生达最高，多数弥散型分布。见表2，图5～8。

表2　Bcl-2、Bax蛋白在口腔正常黏膜、白斑病损区的表达　例

3　讨论

对Bcl-2蛋白的表达，数量有限的报道结果并不一致，Renata等［3］对胎儿、新生儿和成人皮肤组织的研究中发现Bcl-2仅局限于基底细胞。Dekker等［4］的结果也认为Bcl-2可能只是作为基底干细胞的一种标志。本研究系统地观察了由健康口腔黏膜转化为重度上皮异常增生的过程细胞凋亡状况，结果表明上皮中均有Bcl-2的表达，是一种普遍现象，只是在其表达程度、表达强度、阳性细胞分布发生了改变。Bcl-2敲除(kick out)实验证实，新生的小鼠在Bcl-2基因剔除几周后，大部分死亡，小鼠肾内细胞凋亡增多，肾单位减少［4］。结合Bcl-2阳性细胞在上皮中的表达部位，提示生理状况下Bcl-2正常分泌是细胞周期连续运转及细胞数量的相对稳定的需要，是细胞周期运行的驱动力之一。Bcl-2表达有利于顺利通过G2/M周期调控点，触发有丝分裂，缺乏Bcl-2表达则休眠期细胞增多，许多细胞将暂时或永久退出细胞周期。但当细胞周期完成即将通过凋亡而发生克隆消失时，Bcl-2的表达则应下调［5］。

图1　正常口腔黏膜上皮Bcl-2表达与分布(SP×400)

图2　Bcl-2在中度异常增生中的表达(SP×400)

图3　Bcl-2在重度异常增生中的表达(SP×400)

图4　重度异常增生中Bcl-2的表达与分布(SP×400)

图5　正常口腔黏膜上皮Bax的表达(SP×400)

图6　单纯上皮增生Bax的表达(SP×400)

图7　Bax在上皮异常增生的过度表达(SP×400)

图8　Bax在上皮异常增生的过度表达(SP×400)

研究显示，由正常口腔上皮向异常增生转化后Bcl-2蛋白的表达水平明显升高。细胞异型性分级升高，Bcl-2阳性细胞比例也随之增大，中度异常上皮增生达最高，与细胞增殖活性的增加基本成正比关系，而在重度异常增生阶段则有所下降。我们认为细胞凋亡与增殖相辅相承，其增殖与程序性死亡速度的平衡才是决定白斑等癌前病变最终细胞表型的关键。抗凋亡蛋白Bcl-2代偿性增高时，分裂活跃的幼稚型细胞通过选择最终获得了生存优势，尤其是基因水平上能抵抗细胞凋亡具有突变表型的细胞增殖优势得到加强细胞凋亡减少，增殖细胞绝对凋亡率的降低，细胞个体寿命延长，“凋亡细胞”的继续生存直接影响细胞数量增加，获得基因继发突变的机会增加，这是肿瘤形成的一个重要基础，另外Bcl-2过表达可以阻断损伤感受器与细胞凋亡之间的信号传导途径，增强对其它癌基因的易感性。与正常上皮相比，本研究中异常增生上皮Bcl-2蛋白的强阳性表达更多集中于基底干细胞层。基底细胞是分裂最活跃的多能干细胞，具有多向分化潜能，其分化的取向决定细胞的最终表型，一个干细胞的凋亡意义远大于一个浅层分化细胞的凋亡［6］Bcl-2过表达抑制生发层中DNA损伤细胞正常凋亡而保持损伤状态，可使此类染色体不稳定、基因突变细胞的寿命延长，表型改变的不断累积，将促进恶性细胞克隆。虽然Bcl-2的表达不能直接诱导细胞恶性转化，但如果合并转入某些癌基因如c-myc，则很快诱发肿瘤发生［7］。这种诱导生长癌基因细胞与凋亡抑制因子的协同作用，提示细胞凋亡的抑制能够促进癌基因激活肿瘤细胞的存活。因此推测Bcl-2在基底层的过表达也是上皮异常增生初发癌基因事件后促恶性的转化因素之一，诱导了初始基因突变后续事件的发生。

Bax蛋白是在白细胞基因文库中发现的21 k Bcl-2同源蛋白，因RNA剪方式的不同编码三种蛋白Baxα、Baxβ、Baxγ。其中Baxα为跨膜蛋白，可与Bcl 2α结合异二聚体Bcl-2/Bax，或形成同种二聚体Bax Bax，细胞凋亡的调节严格依赖于二者的化学计量。

正常口腔黏膜上Bax蛋白阳性细胞多位于颗粒层，并且呈点状散在分布，这符合黏膜上皮细胞分裂起源于基底层并逐渐向角化层移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。而当上皮出现异常增生时，Bax蛋白的表达随着增生强度改变而强化，强阳性染色细胞大多集中在上皮棘层。文献报道，鼻咽癌组织中的Bax蛋白表达较慢性鼻咽炎组织的免疫反应明显减弱，鼻咽癌中促凋亡基因受到抑制［8］。Dekker等［4］发现在鳞癌阶段Bax蛋白表达下调。由此可见，当增生性质的改变时，若细胞获得恶性表型，Bax蛋白可能失去作用或部分失去作用，肿瘤细胞自发的凋亡可能不再增加，细胞增殖加快。因此，在上皮细胞恶性转化阶段，Bax蛋白表达的异常增高是白斑恶变的早期阶段自我免疫反应，体现了机体为抑制过度生长的细胞群体，新生细胞开始启动了细胞自稳定机制，试图通过Bax/Bax蛋白表达的强化，促进异常增殖细胞的凋亡，维持细胞数目的稳定。细胞凋亡能除去一些有基因突变的细胞，阻止恶性转录，对肿瘤的生长产生副调控作用，使肿瘤发生的时间延迟。在重度异常增生阶段，则是细胞恶性转化加速阶段，通过Bax蛋白表达强化加速一些分裂周期短、增殖快，具有显著恶变表型的异质细胞凋亡，而细胞获得恶性表型，促凋亡基因受到抑制，异型细胞的凋亡受阻，可能是肿瘤发生、发展的一个重要因素。另一方面，Bax蛋白对分裂周期长、增殖慢但具有高侵袭力、尚处在潜伏期的肿瘤细胞的免疫麻痹，丧失清除能力，维持潜在肿瘤细胞增殖率，导致肿瘤细胞生存周期过长，肿瘤细胞聚集造成细胞爆发式恶变，其保留的恶性细胞具有恶性程度高、侵袭力强、预后差。基因敲除实验也说明，细胞凋亡抑制因子如Bcl-2，可以作为癌基因，或者说使细胞凋亡的促进因子如Bax，可以作为肿瘤抑制因子，如果敲除了具有促凋亡活性基因的大鼠肿瘤的发病率升高，则提示这个基因具有抑癌功能［9］。研究显示Bax蛋白阳性表达率在重度异常增生阶段达到最高的84%，而同一病理分期中，Bcl-2表达则有所下降，低于中度异常增生［9］，说明细胞恶转过程中存在促凋亡与凋亡抑制的相互倾轧倾向。

关于细胞数目自稳定启动机制，Adams等［9］认为除Bax、Bcl-2和Bak外，在Bcl-2凋亡蛋白家族中还有一个单BH3结构域蛋白，单BH3结构域蛋白Bim、Bmf能够与线粒体膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用。其活性通过转录诱导、翻译后磷酸化、细胞骨架扣押等机制调节，从而结合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白来诱导细胞凋亡［10，11］，当接到凋亡信号后，Bax与 Bak在线粒体外膜聚集，形成允许细胞色素C通过的通道。在正常细胞中，Bim、Bmf被分别扣押在微管和肌球蛋白而保持无活性状态，caspase8可以裂解激活Bid，磷酸化可以调节Bax的活性。

本实验对调控细胞凋亡的重要调控蛋白进行了研究，显示促凋亡基因受到抑制，癌细胞的凋亡受阻，可能是肿瘤发生、发展的一个重要因素，实际上细胞凋亡和增殖的平衡是决定细胞最终表型的重要因素。细胞恶变发生过程中存在促凋亡与凋亡抑制的相互倾轧倾向。从细胞凋亡的机制出发，通过诱导细胞凋亡的研究，可以争取癌前病变不同阶段对抓住有效治疗时期减少后期恶变的可能性或消除化疗药物所带来的不良反应，对临床检测疾病的转归，预防癌变的发生有指导意义。

参考文献

1Hueber A，Welsandt G，Jordan JE，et al.Characterization of CD95 Ligan (CD95L) induced apopatosis in human tenon fibrolasts.Exp Eye Res 2002，75: 1-8.

2吴冉，黄莉，徐丽，等.放射对鼻咽癌细胞凋亡率和相关基因表达水平的影响.中华放射肿瘤学杂志，2103，61: 1004-1006.

3Renata R，Mauro P，Russell B，et al.Apoptosis in human skin develop ment: morphogenesis，periderm and stem cells.Devlopmental Dynamics 2002，199: 176-183.

4Dekker NP，lozada-Nur F，Lagenaur LA，et al.Apoptosis-associate markers in oral LP.Joral Pathol Med，1997，26: 170.

5许香梅，任晓敏，刘曙光，等.醛固酮受体拮抗剂对心肌细胞凋亡的影响.河北医药，2012，34: 2023-2025.

6Matra RS，Phil S，Kimberly EF，et al.Apoptosis in keratinocytes is not de pendent of induction of differention.Lab Inves，2002，76: 99-107.

7Ekert PG，Read SH，Silke J，et al.Bcl-XL and caspase-9 accelerate apop tosis，but do not determine whether fatctor-deprived or drug-treated cell die.Cell Biol，2004，165: 835-842.

8王茂鑫.鼻咽癌组织中凋亡相关基因蛋白表达及意义.贵阳医学院学报，2005，48: 214-216.

9Adams JM.Ways of dying multiple pathways to apoptosis.Genes Dev 2003，17: 2481-2495.

10郭淑芹，马静静，张云良.细胞凋亡相关因子与耐药性的关系研究进展.河北医药，2014，36: 102-105.

11陈晖，王磊，翁小东，等.缺血后处理对大鼠肾上小管上皮细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的影响.临床误诊误治，2013，26: 104-107.

Expression and significance of Bcl-2 Bax in oral leukoplakia

MAN Yi*，ZHONG Liangjun，XU Weiwei*.*
Department of Stomatology，China National Petroleum Corporation Central Hospital，065000，China

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of apoptosis－related protein Bcl-2，Bax in oral leukoplakia (OLK)，and to explore the mechanism of pathogenesis and cancerization of oral leukoplakia.MethodsThe expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry in 29 cases OLK and 25 cases of healthy oral mucosa.Results The apoptosis indexes (AI) of OLK epithelial cells in simple hyperplasia，dysplasia (mild，moderate，severe degrees ) were significantly increased，as compared with those in normal mucosa.In OLK epithelium，the overexpressions of Bcl-2，Bax in positive cells were observed，and the intensity and distribution of apoptosis-related protein were significantly changed.ConclusionIn precancerous lesions，Bcl-2 may promote the progression of canceration of hyperplastic tissue，enhance the effects of Bax in inducing cell apoptosis，moreover，the effects of apoptosis-related proteins are not only cooperative but also restrict each other.

【Key words】leukoplakia; apoptosis ptotein; Bcl-2; Bax

(收稿日期:2014－11－17

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.004

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1297－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 780.2