HPLC技术分析测定黄曲霉毒素的研究进展

田瑞红，孙健平

（天津桂发祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

HPLC技术分析测定黄曲霉毒素的研究进展

田瑞红，孙健平*

（天津桂发祥十八街麻花食品股份有限公司，天津300221）

黄曲霉毒素是真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）产生的一类有毒的代谢产物，具有很强毒性，能强烈破坏人和动物的肝脏组织，严重时会导致肝癌甚至死亡。现已受到越来越多人群的关注。本文分别介绍柱前衍生化、柱后衍生化以及串联质谱配合高效液相色谱技术分析食品里黄曲霉毒素的方法及研究进展。

黄曲霉毒素；高效液相色谱；食品

1 黄曲霉毒素（Aflatoxius，AFT）概述

黄曲霉毒素（Aflatoxius，AFT）是黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类化学结构和理化性质相似次级代谢产物，目前已发现有20多种，已分离鉴定出结构的有B1、B2、M1等18种。AFT的基本结构为二呋喃环和香豆素，黄曲霉毒素的主要分子型式含B1，B2，G1，G2，M1，M2等。其中，B1则是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，其毒性和致癌性也最强。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素AFB1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，M1和M2则主要存在于牛奶中[1-3]。

1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种天然存在的、毒性极强的剧毒物质，并具有致突变、致畸形和致癌作用。黄曲霉毒素的危害主要是对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡[1-2，4-5]。

2 黄曲霉毒素的分离检测方法

目前，检测黄曲霉毒素的方法有很多。常用的主要有薄层层析法（TLC）、微柱筛选法、竞争性酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）以及新兴起的电化学免疫传感器法等。

TLC法虽然是经典方法，但其实验过程耗时繁琐且净化效果不佳，易受杂质干扰，灵敏度、精密度和重现性不好，更适合于AFT的定性检测。微柱筛选法仅适用于定性检测，其重现性及灵敏度不佳。如若检测多种AFT，需先将样品分离再结合其他方法检测。ELISA法灵敏高、特异性强、成本低、快捷，且荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰，适合于大批量样品的检测。但由于适用酶本身不稳定，在研制抗体时，交叉反应不仅要考虑其他真菌毒素及脂肪、蛋白、糖的干扰，还要考虑中药中化学成分的干扰，因此会导致假阳性率高[6-7]。

HPLC技术可同时检测多种类AFT，适于大批量样品的分析。当前此法已普遍应用于食品、饲料及中草药等黄曲霉毒素的分析检测。随着先进分析仪器设备的不断推出涌现，精进后的HPLC法测定AFT，分析效果更佳[1，8]。

3 HPLC技术分析检测黄曲霉毒素

梁雄宇等[9]将样品均匀粉碎后，用丙酮提取花生中四种黄曲霉毒素后，经Bond Elut PH柱萃取净化，再经更小粒径的ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6mm×150mm，3.5μm）分离，以甲醇、乙腈和水混合为流动相，联合紫外检测器，以此方法很好地实现了对四种黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的分离。检测限分别为：0.5、0.8、0.2、0.4μg/kg。对花生样品加标回收，平均回收率在82%～96%。

然而，考虑到HPLC结合紫外检测器（HPLC-UV）分析AFT可能存在的检测灵敏度低，抗干扰能力差的不足，研究人员现在普遍使用HPLC-荧光检测器法（HPLC-FLD）、HPLC与质谱联用技术（LC-MS，LCMS/MS），将其应用到高通量复杂样品中AFT的检测，进而达到高精确度高灵敏度的的测定要求[10]。在样品进入HPLC系统之前往往需要分析者对样品进行前处理，即分离、纯化过程。另外，在相同分析条件下，由于黄曲霉毒素分子荧光发射强度有所不同，荧光检测器对每种黄曲霉毒素的检测灵敏度不尽相同，即对结构中双呋喃环上的具有饱和结构的B2和G2灵敏度高，而对黄曲霉毒素结构中双呋喃环上具有不饱和双键的B1和G1灵敏度较低，这样一来通常还需对样品进行柱前或柱后衍生化[11]。

3.1 柱前衍生HPLC法测定

王阳[12]、刘洋[13]、陈玉波等[14]将样品经一定体积的乙腈溶液提取，所得提取液通过多功能固相萃取小柱或是自制净化柱净化、浓缩，再加入三氟乙酸（TFA）进行柱前衍生。随后进HPLC体系检测，C18色谱柱分离，配合荧光检测器，外标法定量，样品加标回收，回收率分别在80.4%～94.5%、85%～102%、78%～102%。该方法可同时检测食品和饲料中多种黄曲霉毒素，线性范围广且效果良好。

另外，还可以在样品中加入适量碘衍生剂，衍生后进行HPLC分析。程树峰等[15]用甲醇-水（55∶45）提取后，对比了Si-Gel净化柱、C18净化柱、氯仿萃取3种纯化方法的纯化效果，分别就衍生剂的选择、反应温度、反应时间衍生试剂浓度进行讨论，并确定出最佳的纯化及衍生化条件。经此方法检测4种黄曲霉毒素可在7min内完成，检出限均在pg水平。花生和玉米重复性实验（n=8）相对标准偏差（RSD）分别为4.2%～4.9%和3.2%～6.7%；样品回收率分别为83.5%～ 97.3%和89.4%～97.6%。

3.2 柱后碘衍生及电化学衍生HPLC法测定

研究人员通常需要添加衍生化设备，采用一定浓度的碘溶液为衍生试剂对样品进行衍生化处理，增强黄曲霉毒素的荧光强度，以更有效地完成测定。王树茂[16]用84%乙腈水溶液提取样品，通过Mycosep 226萃取柱净化样品，以Agilent Zorbax SB-C18为分离柱，乙腈/水为流动相，梯度洗脱，用荧光检测器检测。确定出最佳衍生条件，即0.1%碘溶液作衍生溶液，衍生液流速0.4mL/min；衍生温度65℃，得到的结果线性关系良好，最低检出浓度B1、G1为0.23μg/kg，B2、G2为0.10μg/kg，4种黄曲霉毒素的回收率在82%～100%之间，分析发现干（坚）果的品相与黄曲霉毒素污染程度正相关。

郑荣[17]将样品经70%甲醇提取、免疫亲和柱净化后，以甲醇—乙腈—水（27∶18∶55）为三元流动相，0.05%的碘溶液作衍生试剂，衍生反应温度70℃，后用荧光检测器测定，黄曲霉毒素G2、B2在15 pg～60 pg范围内线性关系良好，黄曲霉毒素G1、B1在5 pg～200 pg范围内线性关系良好，r＞0.999 9，回收率在60%～120%之间。

而在线电化学衍生（Kobra Cel1）是直接连在色谱柱和荧光检测器之间，接通电源，利用电化学原理，以在线发生的溴为衍生剂，需要流动相中加入Br-，Br-在电流作用下被氧化成单质溴，后者与AFB1和AFG1反应，生成荧光强度更强的物质，此反应室温下数秒内即可完成，解决了衍生物可能存在的稳定性问题，且不需要在流动相中加任何试剂，无需控制反应温度、流速比例，省去了饱和碘溶液的制备过程[7，18]。

张鹏[18]用80%甲醇水溶液提取花生碎样品，经免疫亲和柱净化，以三元流动相水-乙腈-甲醇（70∶15∶15）洗脱，在流动相中加入一定比例的KBr及浓硝酸供作衍生剂，以Kobra Cell装置在线衍生，荧光检测器检测，13min内即可完成四种毒素的分离，检出限均达到0.1μg/kg，5次平行测定花生样品的RSD为9.2%～15%，加标样0.5μg/kg～9.0μg/kg，回收率为74.8%～97.3%。

陈长法[19]优化了提取方式，选择体积分数84%的乙腈水溶液，高速均质3min来提取花生碎样品，采用多功能柱净化结合柱后电化学衍生高效液相色谱荧光检测花生中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，方法的检出限为0.2μg/kg，检测限为0.5μg/kg，相对标准偏差5.28%～9.56%，回收率85%～110%。

3.3 柱后光化学衍生HPLC法测定

吴燕[20]用乙腈-水（84∶16）溶液提取样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，经多功能柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生，荧光检测器测定，AFB1、AFG1在0.10 ng/mL～10.0 ng/mL，AFB2、AFG2在0.03 ng/mL～3.0 ng/mL范围内有良好的线性关系，其相关系数为0.999 5～0.999 8，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为0.50、0.15、0.50、0.15μg/kg，并选取空白大米和花生两种样品做回收测定，回收率为86.7%～97.2%，相对标准偏差（RSD）0.41%～2.40%。

目前，针对食品中黄曲霉毒素的检测多采用免疫亲和柱净化—高效液相色谱—柱后光化学衍生—FLD测定的方法。

免疫学上，黄曲霉毒素这样的小分子物质属于半抗原，需要偶联到大分子物质上制成人工抗原。将此人工抗原免疫动物后，即可得到高特异性、高效价的单克隆抗体。一定量的抗体固定在合适的载体蛋白上，即可得到相应的免疫亲和柱[21]。样品被免疫亲和柱吸附后，再被极性有机溶剂洗脱。

杨美华等[22]首次通过免疫亲和柱净化—在线柱后光化学衍生-HPLC-FLD体系同时测定甘草中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2和赫曲霉毒素A（OTA）的含量。他们将样品经甲醇—水（80∶20）超声提取后在，在免疫亲和柱上进行净化富集，对比了甲醇-0.5%乙酸、乙腈-0.5%乙酸以及甲醇-乙腈-0.5%乙酸等梯度洗脱条件，最终选取甲醇-0.5%乙酸为流动相，在25min内可实现对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA的分离，检测限分别为0.03、0.015、0.06、0.02、0.25μg/kg，平均样品回收率为76%～103%，RSD低于13%。

光化学在线柱后衍生化装置是将样品通过紫外线照射，使流动相光解出有荧光特性的基团，与黄曲霉毒素B1、G1分子上的活性双键进行羟基化反应，进而生成荧光特性更强、更稳定的物质，防止黄曲霉毒素B1、G1在水溶液中荧光淬灭[21，23]。衍生化装置直接连在色谱柱和荧光检测器之间，与其他需要加入额外的泵用衍生化试剂来提高荧光强度的的衍生体系相比，无腐蚀性，更稳定，反应快速稳定，操作简便快捷，且灵敏度高，重现性好[11]。

3.4 HPLC-MS/MS法测定

目前检测黄曲霉毒素的国标方法为免疫亲和柱-液相色谱串联质谱法。集高效分离和多组分定性、定量于一体的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术在食品安全领域得到了广泛应用，它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，可以对多种化合物进行定性和定量分析。相比于HPLC法，该法无需进行柱前或柱后衍生处理，操作相对简捷，该方法灵敏度更高，分析时间较短。

在液质联用技术中，流动相的选择要综合考虑色谱系统分离效果以及分离各组分进入质谱后离子化的效率，以便获得最佳的分辨率和最高的灵敏度。黄曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，往往研究人员分别选用甲醇、乙腈与水混合做流动相作对比。更多的实验表明，虽然乙腈在液相中的洗脱效果稍强于甲醇，但是用乙腈做流动相时的离子丰度明显降低，说明乙腈的离子化效率低，所以通常采用甲醇作为流动相。为了促进样品的离子化，可能会在流动相中分别加入一定浓度的甲酸、乙酸或是乙酸铵，大多结果表明加入甲酸时的离子丰度最强，且样品各组分的分析时间也比较少，从而达到了快速检测的目的[24-26]。

赵晓娟[27]把花生油样品经甲醇-水、三氯甲烷依次提取，以C18柱分离，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱，采用电喷雾（ESI）正离子多反应监测（MRM）模式检测。最终标准曲线在0.0μg/kg～20.0μg/kg进样范围内线性良好，并测定了4种黄曲霉毒素，其回收率在70.8%～108.0%（低加标水平）、82.4%～104.5%（中和高加标水平）之间，相对标准偏差在5.7%～9.7%之间。同时将此方法对市售19种不同品牌和批次的花生油中的黄曲霉毒素进行分析。

王岩松[28]把谷物样品研磨成粉末，直接用体积分数10%的甲醇水溶液提取，经Oasis HLB固相萃取净化，流动相选取乙腈-水（0.2%甲酸），进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描多反应监测（MRM）模式，外标法定量，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的定量下限分别为0.1、0.1、0.2、0.3、0.2ng/g，平均回收率在74.6%～89.6%之间，测试的精密度（RSD）在5.2%～11.3%之间。并用此法检测了市购的10批陈年谷物和10批新谷物谷物样品。

李培武[29]用液相色谱-电喷雾三重串联四极杆质谱技术测定了玉米、大米、大豆等粮油固体样品中黄曲霉毒素。利用超声提取样品，优化了超声提取条件，选用体积分数80%甲醇-水（含40 g/LNaCl）为溶剂，溶液料液比为1∶3（g/mL），超声温度为50℃，超声提取3min；后把提取的样品经免疫亲和特异性净化，与液相色谱-电喷雾三重串联四极杆质谱联用，使用C18反相色谱柱，甲醇-10mmol/L乙酸铵水溶液作流动相，梯度洗脱，而采用黄曲霉毒素M1（AFM1）作为内标进行定量测定，测试结果得到AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的检出限分别为0.002、0.004、0.004、0.012μg/kg，此方法的加标回收率为87%～111%，并测试了日内相对RSD和日间RSD，实验结果表明该方法可有效地降低基质效应的影响。同时该课题组[30]采用同样的前处理过程，免疫亲和微柱净化，液相色谱-串联离子阱质谱法和高效液相色谱法同时测定花生、玉米和大米中的4类黄曲霉毒素并对这两种方法进行了比较，更准确的反映出液相色谱-串联质谱在实际应用中的优势。

4 结语

黄曲霉毒素对粮食食品的污染非常广泛，现如今，已经受到来自包括科学家们在内的各方面的特别关注。随着先进仪器技术不断发展，HPLC技术特异性强、灵敏度高、检测限低、定量结果准确、自动化程度高的优势愈发凸显，而HPLC与各种先进分析手段、检测设备的相互结合，已逐渐成为AFT检测技术的发展趋势。在未来，相信此项技术在食品等更多的领域黄曲霉毒素测定中发挥更大的作用。

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Research Progress of Analysis and Determination of Aflatoxin by HPLC Technology

TIAN Rui-hong，SUN Jian-ping*
（Tianjin Guifaxiang 18th Street Muahua Food Co.，LTD.，Tianjin 300221，China）

Aflatoxin was a kind of toxic metabolite，which was produced by fungi（e.g.，aspergillus flavus and parasitic aspergillus）and had very strong toxicity.It could damage the liver tissue of humans and animals strongly，would lead to seriously liver cancer and even death.Attentions were paid by more and more people. Analysis methods and research progress of precolumn derivatization，post-column derivatization and tandem mass spectrometry cooperated with high performance liquid chromatography technology were introduced respectively in food.

aflatoxin；high performance liquid chromatography；food

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.041

2014-04-08

田瑞红（1974—），女（汉），工程师，学士，研究方向：食品质量安全。

*通信作者