多酚与蛋白质、消化酶相互作用的研究进展*

刘婵，何志勇，秦昉，曾茂茂，陈洁

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

在食品工业中，提高食品的营养和功能品质是产品研发和加工制造的主要目标，例如通过结合2种具有生物活性的化合物来开发新型功能性食品，现在许多营养食品就同时含有多酚和乳蛋白，如奶茶、果奶、可可奶和咖啡奶等产品。多酚具有抗癌、消炎和抑菌的功效，也可促进血管生成、预防慢性疾病和动脉粥样硬化的发生，降低糖尿病、心血管疾病和癌症的发病率［1］。乳蛋白包括酪蛋白和乳清蛋白，含有人类全部必需氨基酸，营养价值丰富，生物学价值较高，消化率可达98%［2］。许多研究表明多酚与乳蛋白的相互作用会破坏蛋白质的二级结构，从而降低蛋白质的溶解度和消化性，同时也降低了多酚的抗氧化性，影响食品的感官和功能特性［3］，因而探究多酚与蛋白质相互作用对食品营养学和生命科学具有重要意义。由于消化酶对于营养物质的消化吸收具有关键作用，但是对于复合体系在机体消化环境中消化酶存在下的竞争作用以及消化酶对复合物营养性和功能性的影响尚不太清楚。因此，研究人体消化环境中在消化酶存在下，多酚与乳蛋白、消化酶相互作用及其对多酚生物利用性和抗氧化性的影响状况，对于提高产品的营养健康功能具有十分重要的指导意义。

1 多酚和蛋白质相互作用

1.1 相互作用机理

多酚类物质具有与蛋白质选择性结合的能力，不同多酚对不同蛋白质亲和力具有一定差异［4］。多酚是植物的次级代谢产物，由多个羟基基团连接到芳香环上构成［5］。蛋白质包含20种不同的氨基酸，而氨基酸是由一个α-碳原子共价结合一个氢原子、一个氨基、一个羧基和侧链基团［6］。酚类小分子化合物通过渗入蛋白质分子的内部与肽链交联。多酚与蛋白质的结合分为可逆性和不可逆性，可逆性的结合就是一些非共价作用，包括氢键作用、静电吸附和疏水作用等［7-8］。氢键的形成主要是通过多酚中的氢原子与蛋白质中的电负性离子如N、O或S结合;静电吸附是酚类小分子通过正负离子交换而吸附到蛋白质分子表面，作用力较弱;疏水作用是非极性基团间形成的较强的作用力［4］。不可逆性结合则包括了共价键和离子键的结合［9-10］。目前，对于多酚与蛋白质间非共价键结合的研究较多，而对于共价键结合作用研究较少。

1.2 相互作用测定方法

多酚与蛋白质相互作用的亲和力、化学计量学、动力学、热动力学和构象变化等特征参数通常用毛细管电泳法、电喷雾质谱法(ESI-MS)、高性能亲和色谱法(HPAC)、核磁共振光谱和多光谱法等方法测定［11］。多光谱法［12］包括荧光光谱法、红外光谱法、紫外光谱法和圆二色谱法，是测定多酚-蛋白质相互作用的常见方法，在这些方法中，荧光猝灭技术可以确定多酚和蛋白质之间的结合常数和结合位点的数目，方法较为简单因而得到广泛应用。Wu等［13］利用荧光猝灭法、圆二色谱法研究发现EGCG和β-乳球蛋白间通过氢键和疏水作用紧密结合，同时破坏了β-乳球蛋白的空间结构。Moser等［14］通过荧光猝灭法研究发现乳蛋白与黄烷-3-醇相互作用可以改变黄烷-3-醇的生物有效性，但在胃肠消化环境中会降低特定蛋白质与其相互作用的影响。

1.3 多酚与乳蛋白的相互作用

多酚与乳蛋白的相互作用可改变食品中乳蛋白的营养价值和多酚的功能性质，主要影响多酚的抗氧化性。Dubeau［15］采用不同的抗氧化性测定方法发现，在溶液和固液体系中牛奶将抑制茶多酚的抗氧化性，相反在油浊液中，牛奶会增强茶多酚的抗氧化性，从而认为牛奶中蛋白质对茶多酚的抗氧化性具有双重影响。Ryan［16］研究表明牛奶可降低茶多酚的抗氧化性，其中脱脂奶对多酚抗氧化性的降低程度高于全脂奶和半脱脂奶。同时Sharma［17］分析发现加入牛奶的黑茶中多酚的抗氧化活性低于黑茶的抗氧化活性。

另外，多酚与乳蛋白的结合会破坏乳蛋白的二级结构，从而影响乳蛋白的功能性质如乳化性、热稳定性和抗氧化性。Hasni，Kanakis等［18-19］分别对 α、β-酪蛋白和β-乳球蛋白与茶多酚儿茶素衍生物的相互作用进行了研究，利用红外光谱，紫外可见光，圆二色谱和荧光光谱方法以及分子模型对其结构进行分析表明，多酚与酪蛋白的结合会减少酪蛋白分子的α螺旋和β-折叠，增加其无规则卷曲和回转，从而改变酪蛋白的二级结构。Wang等［20］研究发现在pH 8.0，60℃的条件下，EGCG与α-乳清蛋白结合可降低溶液的浑浊度，同时也可提高α-乳清蛋白的乳化性，从而增强体系的稳定性。O'Connell等［21］向脱脂奶中分别添加绿茶、黑茶、可可粉和咖啡，发现茶类富含的多酚物质可与乳蛋白相互作用，增强酪蛋白胶束的稳定性，从而增强了脱脂奶在140℃高温下的热稳定性。

1.4 多酚与消化酶的相互作用

多酚有多种有益作用，通过清除体内金属离子或激活抗氧化酶的活性达到保护机体的功能。许多研究表明，多酚中的某些种类还可以通过改变消化酶的活性来对人体产生其他有益效果［22］。多酚可以通过抑制消化酶对脂类和淀粉的分解从而减少热量的摄入，起到预防肥胖以及维持血糖稳定的作用，达到调节营养成分生物利用性的有益效果。同时某些多酚如原花青素对人体还有抗营养作用，该抗营养作用也是由于原花青素与消化酶之间相互作用的结果。原花青素与消化酶的相互作用主要包括对脂肪酶、蛋白酶以及葡萄糖苷酶的抑制［23］。

多酚对消化酶的抑制作用主要是因为多酚与消化酶的结合，使消化酶分子结构发生变化，致使酶活性降低。Wu等［24］利用荧光光谱法、圆二色谱法和分子对接研究方法测定苦茶中苯丙素苷类化合物与胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等消化酶的相互作用。由于消化酶分子中疏水基团与苯丙素苷类化合物的疏水作用从而使酶分子中极性基团(如-OH、-SH和-NH2基团)与苯丙素苷类化合物中的-OH基团形成氢键结合，改变了消化酶的极性，从而抑制消化酶的活性。

多酚对消化酶的抑制作用强弱与多酚含量和种类以及消化酶的种类密切相关。Goncalves等［25］利用分光光度法研究葡萄籽中花青素和不同葡萄酒中单宁对胰蛋白酶的抑制作用，结果表明，多酚的平均聚合程度与对胰蛋白酶的抑制作用有直接关系。此外，不同类型葡萄酒中，因酚类物质含量不同，对胰蛋白酶活性的抑制程度也不同，随着酚类物质含量的增加对胰蛋白酶活性的抑制作用增强，并且证实了缩合单宁作为抗营养因子，可抑制蛋白质的消化作用，减少营养素的吸收。McDougall等［26］利用体外实验研究不同浆果中多酚物质对α-淀粉酶的抑制作用，通过测定其IC50值得出树莓和花楸浆果的抑制效果最好，并利用液相色谱质谱联用技术分析树莓和花楸浆果中起抑制作用的成分主要为原花青素，花楸浆果中原花青素与淀粉酶通过疏水作用结合，从而抑制淀粉酶的活性。原花青素对淀粉酶的抑制作用减少了对阿卡波糖(降低血糖的药)的分解，达到控制人体餐后血糖浓度和预防肥胖的作用。He等［27］测定茶多酚对不同消化酶如α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶的抑制作用，发现茶多酚对α-淀粉酶的抑制作用最强，其次是脂肪酶，最后为胃蛋白酶和胰蛋白酶。

2 消化环境中多酚与乳蛋白的变化及相互作用

2.1 多酚在消化环境中的变化

许多研究表明，多酚在体内代谢吸收过程中对于降低冠状动脉心脏疾病、癌症以及胃肠道疾病发病率［28］等方面发挥了重要作用，目前普遍认为多酚的消化吸收主要发生在小肠部位［29］。消化环境中对多酚影响较大的是胃肠道的pH值。绿茶中儿茶素的稳定性与溶液pH密切相关，在pH为3和4时相对稳定，但它在 pH值为5和6时很容易降解［30］。Andrew等［31］在体外模拟消化环境的实验中已经证明，儿茶素在模拟酸性胃环境中较稳定，在模拟肠道的近中性或碱性pH环境下大幅度降解。而在模拟小肠环境中EGCG和EGC最敏感，ECG较为稳定，EC和C最稳定。消化过程中，儿茶素类衍生物的降解大多发生在小肠环境中，在肠液环境中的损失量通常比胃环境中的损失量高10～20倍。同时，Record等［32］在研究不同品种茶叶在消化环境中的变化也发现，各种茶叶中儿茶素在酸性胃环境的培养几乎没有影响，然而在小肠中微碱性pH环境下培养，绿茶和红茶中儿茶素的浓度迅速下降，且绿茶中儿茶素的损失量高于红茶。

在消化环境中，多酚的抗氧化性、生物可及性和生物利用率都会受到影响，并且不同种类的多酚经过消化环境，其功能性变化不同。Fereidoon等［33］通过模拟体外消化和微生物发酵研究消化过程对5种不同谷物中酚类物质的抗氧化能力和生物利用性的影响，发现经消化酶的水解作用，谷物抗氧化活性增强，谷物中多酚的生物可及性提高，这是因为消化酶的作用有利于多酚从含有不溶性纤维的谷物中释放。Tagliazucchi等［34］发现食物中的酚类物质在胃肠消化环境中释放而被吸收，在胃消化过程中总酚、黄酮类和花青素类的生物可及性增加，而在肠道环境中酚酸和白藜芦醇降解，儿茶素、槲皮素则相对较稳定。Bermudez-Soto等［35］也对阿龙尼亚苦味果汁中主要多酚化合物在体外胃肠消化环境中的稳定性进行了研究，发现胃的消化对酚类化合物无显著影响，而酚类在小肠消化过程中的变化较为显著，其中花青素损失最多(大约43%)，黄酮类和黄烷-3-醇含量分别下降26%和19%，而绿原酸含量增加了24%，并认为食物多酚在小肠消化中的显著变化主要是因为多酚类化合物在小肠碱性条件中转变成其他具有不同生物有效性、生物利用度和生物活性的未知化合物。Gian等［36］通过模拟胃肠消化环境，研究血浆蛋白与白茶、绿茶和红茶中茶多酚的相互作用，发现相对于红茶和绿茶，白茶中儿茶素衍生物含量最丰富，在肠道中，白茶中儿茶素也具有较高的生物有效性和生物利用度，白茶中EGCG、EGC和ECG的积累量高于绿茶和红茶，而白茶中EGCG和EGC比ECG和EC更容易消化。

2.2 多酚与乳蛋白在消化环境中的相互作用

有研究提出，食品多酚在消化过程中抗氧化性、生物可及性和生物利用率的变化与多酚和蛋白质相互作用的强弱有很大关系。Xie等［37］利用模拟体外消化环境和Caco-2细胞模型，探究绿茶中添加牛奶对绿茶中儿茶素衍生物有效性和肠道吸收的影响，发现绿茶中ECG和EGCG与牛奶中的蛋白质结合力较强，而EC和EGC的蛋白质亲和力较弱，绿茶与牛奶混合液中儿茶素衍生物在Caco-2细胞中的回收率显著高于无乳的绿茶溶液，并认为是由于乳蛋白与儿茶素的相互作用促进了儿茶素的吸收，从而提高了儿茶素的生物利用度。Green等［38］研究发现茶与谷物奶的混合可使茶中总儿茶素的回收率增加69%，茶中加入50%的大米乳也可使EGC和EGCG的回收率分别达到74.0%和69.7%，而在消化实验中，观察到EGC和EGCG显著下降，而EC和ECG保持其稳定性，Green等认为蛋白质的消化，将破坏儿茶素与蛋白质相互作用使儿茶素衍生物暴露于消化环境中，从而促进了儿茶素衍生物的降解。

食品多酚与乳蛋白相互作用不仅会影响多酚的抗氧化性和生物利用率，也会影响乳蛋白的消化性，进而影响食品复合体系的营养和功能特性。He等［39］研究果奶体系在消化环境中乳清蛋白的消化性，得出在胃消化阶段，儿茶素和绿原酸对乳清蛋白的消化性影响不大。在小肠阶段，多酚可显著降低乳清蛋白的消化性，随多酚浓度的增加抑制效果增强，并且儿茶素对乳清蛋白水解度的抑制作用大于绿原酸。Marija等［40］认为膳食多酚和β-乳球蛋白的结合可降低蛋白质的消化率和体系的抗氧化活性，多酚与蛋白的非共价键结合延迟β-乳球蛋白的消化，促使β-乳球蛋白β-折叠向α-螺旋转变。苑博等［41］也发现酚类物质通过与乳清蛋白以及蛋白酶的相互作用使乳清蛋白的消化率降低，酚类物质浓度越大对蛋白质消化率的影响越大。体外消化过程中，乳清蛋白及乳清蛋白与酚类物质混合物的ABTS自由基清除能力提高，铁离子还原能力降低，酚类物质与乳清蛋白相互作用对抗氧化性的影响通常不变，蛋白酶对柚皮苷和绿原酸的抗氧化性影响不大，却降低了儿茶素抗氧化性。

3 展望

在食品工业中，奶茶和果奶是多酚类物质作为功能性配料在含乳食品中应用的典型产品，多酚的加入既可以改善含乳食品的口感，也可以增强其抗氧化活性。本文介绍了近年来乳蛋白与食品多酚相互作用、多酚与消化酶的作用以及多酚、乳蛋白和多酚-乳蛋白复合体系在体外消化环境中变化的研究进展情况。然而目前研究仅仅局限在多酚和乳蛋白、多酚与消化酶、乳蛋白与消化酶两者之间的作用，而对于在消化环境下食品多酚与蛋白质、消化酶之间到底存在怎样的竞争相互作用关系，这种竞争相互作用强弱对食品体系抗氧化性、消化性、生物利用性及健康功能会产生什么样的影响尚不清楚。所以，今后需要进一步从分子水平上分析研究蛋白-多酚、多酚-消化酶在消化环境条件下相互作用的类型、大小及相互竞争关系，并探寻三者相互作用对食品体系蛋白质营养性及多酚功能性的影响规律，这对于提高产品的营养价值和健康功能品质具有重要意义，将为蛋白质-多酚复合类功能性食品的开发利用提供科学依据和重要理论基础。

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