树鼩遗传多样性的研究进展

杨香娣，曹骥，杨春

（广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021）

早期学者认为树鼩在分类学上被视为攀鼩目，它是形似松鼠的一种小型哺乳动物。目前，攀鼩目一共包括笔尾树鼩科和树鼩科2科5属。树鼩科下有菲律宾树鼩属、细尾树鼩属、南印树鼩属和树鼩属4个属，但笔尾树鼩科只包含了笔尾树鼩属1个属，也有人提出了该把菲律宾树鼩属归类于树鼩属［1］。目前地理区域分布最广的攀鼩目动物是中缅树鼩。但由于国内地理优势和树鼩的分布特征，对树鼩的研究在国内偏多且处于领先地位，但现用于实验的树鼩多数来自野外或品系不纯，对树鼩群体的遗传背景尚不太清楚，这使树鼩在科学研究中的管理和应用受到了极大的限制。因此，通过开展对树鼩群体遗传多样性的研究，建立一个遗传背景清晰明了的树鼩品系十分重要。随着研究和保护生物多样性成为目前世界各地的关注热点，物种遗传多样性的研究受到了越来越多的重视。通常说到的遗传多样性是指种群之间和种群内不同个体间的遗传变异总和。研究某一物种的遗传多样性不但可以了解到其群体遗传结构与多态性差异，同时也为物种分类、充分利用与保护已有的种质资源提供重要的依据。遗传多样性的研究主要包括表型、染色体、蛋白质及DNA水平等方面的内容。现将目前国内外对树鼩遗传多样性在各水平的研究动态综述如下，以期为树鼩的合理利用和遗传育种提供更多的依据。

1 表型多样性

基于表观形态特征的研究是遗传多样性研究最直接和原始的方法，然而由于树鼩的表型多样化，目前国内外学者对树鼩的分类方法并不一致。王应祥［2］通过标本采集等方法研究了中缅树鼩不同亚种之间的表型水平差异，发现在体型大小、体质量大小、尾长等方面存在不同特征，进一步说明树鼩种内遗传变异是多样的，不同性状在不同水平上的变异程度也不同。Wu等［3］通过测量昆明近郊树鼩的体质量发现，同一种群内4～12月龄树鼩雄性个体体质量显著高于雌性个体，且随着月龄的增加，这种性别之间的差异会逐渐减小。李波等［4］通过对树鼩解剖发现，7～9个月龄雌、雄树鼩在心、肺、左海马、右肾、左右甲状腺、左颌下腺、左肾上、小肠、腺膀胱、右海马重量及系数都有较明显差异;而右颌下腺、脾及左肾仅重量有明显差异，无系数大小差异;胃、脑、大肠、右肾上腺系数有差异，但重量上无差异。于永梅等［5］通过对人工繁殖条件下的35只中缅树鼩主要外貌特征研究，发现中缅树鼩典型的外貌特征是野生型，毛色有季节性红斑、没有白眼圈、白腹、耳朵不竖、尾尖呈圆形、掌底肤色为肉色、两侧乳房每对之间的连线都分别与体轴线垂直。也有学者通过对分布于云南、广西和贵州地区190个中缅树鼩的头骨和32颗臼齿的形态特征进行初步研究，结果发现他们的形变多集中在臼齿和鼻骨，这可能与中缅树鼩栖息的地理环境和气候有关［6］。上述研究结果说明，不同地区树鼩群体之间存在显著差异，通过树鼩表型多态性能简便、易行、快速区别种属甚至亚种，但目前研究的实验树鼩大多来自野生群体，表型特征差异不一定都是遗传变异的真实反映，而且受到外界环境、生活习性等多重因素的影响，因此建立一个遗传背景清晰的树鼩品系还必须结合其他的标记技术，进行更深层次的研究。

2 染色体多样性

作为遗传物质载体与基因携带者，染色体变异可引起遗传变异的发生。刘瑞清等［7］比较了中国西南部树鼩的三个亚种染色体特征，结果显示越北亚种、滇西亚种、瑶山亚种的染色体数目都是62，且G带与C带基本相似;核仁银染区的数目也相同（4～6个），且分布相似。研究表明，三个亚种都为二倍体，亚种之间核型基本上相同，从而为树鼩的分类鉴定提供了细胞遗传学依据。我们知道染色体水平上的研究不易受到环境的影响，但是目前染色体的细胞学标记数目和结构变异都非常有限，从而限制了这一技术方法在亚种分类中的应用。

3 蛋白质多样性

蛋白质相对复杂，而且研究方法相对有限，因此关于树鼩蛋白质多样性的研究也相对较少，主要是集中在对其血液成分和同工酶等方面的研究。酶是基因表达的产物，其多肽链中的氨基酸序列多由结构基因的核苷酸序列决定，同工酶的产生主要是由于构成酶蛋白亚基的氨基酸组成和顺序不同所导致的。同工酶普遍存在于生物界，并呈共显性，通过电泳技术测定的方法简易、获得结果迅速，因此研究起来相对方便。季维智等［8］利用同功酶丙烯酰胺圆盘电泳技术，通过对云南昆明、瑶山和广西南宁地区树鼩的乳酸脱氢酶（LDH）同功酶和种群的关系进行了研究，结果提示不同地域的树鼩LDH同功酶酶谱表现出一定的差异，这与王应祥等对树鼩形态学分类的研究结果一致，即昆明、南宁和瑶山树鼩应为三个不同的亚种。虽然同工酶具有相对稳定性，但是多数情况下同工酶水平研究的可靠性均较DNA水平研究低，并且同工酶具有组织特异性，易受发育阶段的影响。

4 基因多样性

作为遗传多样性的本质，基因多态性是最直接、最可靠的多态性，它包括了染色体多态性和线粒体DNA（mtDNA）多态性。因此，基因多态性研究主要为核DNA多态性和mtDNA多态性研究。虽然基因信息量大，但研究方法相比蛋白来说具有更多的选择性，如常用的有直接测序，限制性内切酶片段长度多态性、微卫星DNA标记、单核苷酸多态性（SNP）标记、随机扩增多态性标记等方法。如杨芳等［9］通过对30 只中缅树鼩的 Car2、Es3、Akp1、Trf、Ce2、Es1 等 6个酶基因位点进行检测及计算分析，了解树鼩遗传多态性。结果发现 Car2、Es3位点无遗传多态性，而Es1、Akp1、Trf、Ce2 位点具有遗传多态性，并且多态性较高。虽然目前关于基因多态性的研究方法比较多，但现在比较成熟及常用的方法主要有微卫星DNA标记、SNP标记、随机扩增多态性标记等技术，且都是表现出染色体DNA中核苷酸的排列顺序变化［10］。

4.1 微卫星DNA多态性 微卫星DNA又称简单重复序列，广泛存在于真核基因组中，指的是在DNA基因组中比10个核苷酸小的简单重复序列。目前，对树鼩的基础生物学方面研究相对比较滞后，对整个基因组上微卫星位点的分布和遗传特征尚没有一个系统性的研究和认识。Srikwan等以普通树鼩为对象，利用微卫星技术筛选出了6个微卫星位点，并对野生树鼩的种群内多样性以及种群间的关系进行了研究。随后，Munshi-South等［11］也筛选出5个微卫星位点，并研究了其遗传多样性。何保丽等［12］利用PCR扩增技术对30只中缅树鼩个体的11个微卫星位点进行了遗传检测，结果发现其等位基因数为2～12个不等，杂合度为0.242～0.801，每个位点的多态信息含量范围为0.198～0.699，平均多态信息为0.518，这在一定程度上说明了在同一地缘和同一种群中，个体间也存在着DNA多态性。然而，这些研究中所使用的技术方法可能对于识别检测到的微卫星位点多态性存在着一定的判读误差。为此，Liu等［13］对中缅树鼩20个多态性的微卫星基因座扩增，其中只有14个能够成功扩增，有6个未能扩增出来或者是条带非特异，随后便对这成功扩增的14个基因进行测序对比，发现TB9和TB14的重复序列都有一定程度的突变，即AAG变成了GAG。然后再用这14个微卫星基因座对117只中缅树鼩检测，发现TB2和TB10无多态性，而剩下的12个基因座不仅具有多态性，同时也表现出较高的期望杂合度，这提示我们在培育纯化树鼩品系时，种群内的个体基因多态性是不能忽略的因素。虽然目前对中缅树鼩开展了一些研究，但针对亚种、各地理群体间遗传多态性的比较系统的研究尚缺乏，这将极大地限制对树鼩遗传资源的保护和利用，也是今后科研工作中的难点和重点。

4.2 随机扩增长度多态性（RAPD）RAPD DNA标记也可作为遗传标记用于树鼩遗传多样性的研究。RAPD具有DNA用量少、技术简单、不需探针、多态性识别率较高、安全性较好等优点而被广泛应用于遗传多样性的研究［14］。黎嘉敏等［15］先从 40条随机引物挑选出了20条重复性好和特异性较强的RAPD引物，对从昆明郊区野外捕捉的成年中缅树鼩进行PCR扩增，结果检测到的多态位点有69个，多态位点比率达到61.1%。个体间遗传距离范围在0.09 ～0.27，遗传距离平均为 0.169 3，这提示个体之间遗传差异较大，进一步分析发现有48.29%多态性位点来源于群体内，51.71%来源于雌雄群体间。研究表明，所筛选的随机引物可有效地用于分析中缅树鼩种群的遗传结构，这对于树鼩种群的保护、利用和选择育种以及实现树鼩实验动物标准化具有十分重要的意义。

4.3 mtDNA多态性 mtDNA是存在于胞内线粒体中的一种遗传物质。mtDNA因具有高拷贝、母系遗传的特点，从而被广泛应用在群体遗传学和法医学等研究领域［16］。陈仕毅等［17］分析了80只源于云南昆明周边地区的野生树鼩mtDNA多态性，并结合国外报道的2个树鼩序列比对，发现其具有较高的群体遗传多样性。此外，还发现了昆明地区的树鼩和国外所报道的2个树鼩间存在较大的遗传分化。研究结果提示，基于昆明地区树鼩与国外树鼩之间存在着较大遗传差异，说明mtDNA的研究可以用于对树鼩种群遗传多样性的分析。随后朱万龙等［18］通过测定禄劝、剑川、丽江3个地区种群的线粒体Cytb基因的全序列与控制区D-loop基因区段，对Cytb基因的检测发现了47个多态性位点，其中有24个简约信息位点，23个单变异位点，进一步分析发现禄劝、剑川、丽江3个地域的中缅树鼩种群内遗传距离分别是0～1.7%、0 ～1.2%、0 ～1.1%;而这3 个地区树鼩种群间的遗传距离分别是0.1% ～1.9%（禄劝—丽江）、0.1% ～1.9%（禄劝—剑川）、0 ～1.2%（剑川—丽江）。对D-loop基因检测发现有21个多态性位点，其中简约信息位点和单变异位点分别有11、10个，种群内遗传距离分别是 0 ～1.1%（禄劝）、0.3% ～1.4%（丽江）;树鼩种群间的遗传距离分别是0.3% ～1.4%（禄劝—丽江）、0.5% ～1.2%（禄劝—剑川）、0.1% ～1.1%（剑川—丽江）。进一步数据分析得出，3个地区的中缅树鼩明显可分为两支，一支全是禄劝种群，另一支基本上是剑川—丽江种群（除1个为禄劝单倍型）。此外，通过进化网络关系推测禄劝种群更接近祖先种，而横断山种群（剑川、丽江种群）可能是禄劝种群改变而来，且因横断山地区特殊的生态环境使其拥有的遗传多样性更高，实验结果同时提示中缅树鼩可能出现由南向北的扩散模式。

上述DNA分子标记都是以个体间核苷酸序列差异为基础的遗传标记。DNA多样性研究具有数量多、高度多态、呈共显性遗传等优点，但是目前尚没有一种DNA分子标记技术是令人十分满意的，仍需要进一步地探索出重复性好、可靠性高、操作简易的分子标记技术［19］。

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