明矾对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响及机制探讨

郝剑，吴雄志

(1天津医科大学肿瘤医院，天津300060;2国家肿瘤临床医学研究中心;3天津市“肿瘤防治”重点实验室)

研究［1～3］发现，TGF-β1信号通路可抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。在肝癌细胞中，TGF-β1/Smad信号通路可抑制肝癌细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［4］。如果肿瘤细胞内 TGF-β1信号通路发生突变，其抑制作用将受到限制。因此，重新修复激活TGF-β1信号通路的抑制作用，成为肿瘤治疗的新靶点。明矾主含含水硫酸铝钾，具有收湿敛疮、止血化腐作用。现代研究发现，明矾可以控制烧伤创面绿脓杆菌感染，治疗慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡、传染性肝炎，并且其治疗肝炎的作用机制与TGF-β1有关［5～15］。2014年2～10月，我们观察了明矾对肝癌细胞增殖的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及药物 人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721(天津市肿瘤医院实验室)，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于5%、37℃条件下培养传代。明矾购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.2 肝癌细胞增殖检测 选择对数生长期HepG2、SMMC-7721细胞，以1×104/孔的浓度接种到24孔板，分别设置实验组及对照组(HepG2细胞设为实验1组和对照1组，SMMC-7721细胞设为实验2组和对照2组)，实验组细胞贴壁后分别加入50、100、150 μg/mL的明矾，对照组加入等体积的DMEM培养基，加药后分别于 24、48、72、96、120、144、168 h终止反应，消化、收集细胞，在倒置显微镜下进行计数，并作出生长曲线。实验组和对照组均设置3个复孔。

1.3 肝癌细胞周期及凋亡检测 采用流式细胞仪。选择对数生长期HepG2、SMMC-7721细胞，以5×104/孔的浓度接种到6孔板上，分别设置实验组及对照组(HepG2细胞设为实验1组和对照1组，SMMC-7721细胞设为实验2组和对照2组)，实验组细胞贴壁后加入100 μg/mL的明矾，对照组加入等体积的DMEM培养基，药物处理96 h后，收集细胞制成单细胞悬液，按试剂盒(美国BD公司)说明书进行PI染色，检测细胞周期。用AnnexinV-FITC/PI荧光染色，检测细胞凋亡情况。

1.4 肝癌细胞 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 检测采用RT-PCR法。选择对数生长期HepG2、SMMC-7721细胞，以1×105/孔的浓度接种到6孔板上，分别设置实验组及对照组(HepG2细胞设为实验1组和对照1组，SMMC-7721细胞设为实验2组和对照2组)，实验组细胞贴壁后加入100 μg/mL的明矾，对照组加入等体积的DMEM培养基，药物处理96 h后，提取细胞总RNA，取2 μg RNA逆转录合成cDNA链，并以1 μL cDNA作为模板，进行 RT-PCR。所用引物:TGF-β1:5＇-GGCCCTGCCCCTACATTT-3＇，5＇-CCGGGTTATGCTGGTTGTACA-3＇;p21WAF1/CiP 1:5＇-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3＇，5＇-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAAT-3＇;bFGF:5＇-GATCCCGGGCGCTGCAGCTTG-3＇，5＇-GTTCACGGATGGGTGTCTCCGCG-3＇;Cyclin E:5＇-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3＇，5＇-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3＇;GAPDH:5＇-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3＇，5＇-CTGTTGCTGTA-GCCAAATTCGT-3＇。

1.5 肝癌细胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白检测 采用ELISA法。选择对数生长期HepG2、SMMC-7721细胞，以1×105/孔的浓度接种到6孔板上，分别设置实验组及对照组(HepG2细胞设为实验1组和对照1组，SMMC-7721细胞设为实验2组和对照2组)，实验组细胞贴壁后加入100 μg/mL的明矾，对照组加入等体积的DMEM培养基，药物处理96 h后，裂解细胞提取蛋白，分别稀释 10、100、1 000、10 000倍后按照ELISA试剂盒(达科为)说明书于490 nm酶标仪检测蛋白含量，确定稀释100倍时OD值大小最适宜。分别取稀释100倍的蛋白裂解液检测实验组、对照组细胞内 TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 100 μg/mL的明矾对 HepG2 细胞株在第 1、2、3、4、5、6 天的抑制率分别为 7.3%、1.3%、23.2%、53.7%、68.6%、97.3%，100 μg/mL的明矾对SMMC-7721细胞株在第1、2、3、4、5、6 天的抑制率分别为 3.6%、4.5%、14.1%、28.3%、47.2%、81.9%。明矾对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721均有抑制作用，且抑制率具有时间和剂量依赖性(P均＜0.05)。

2.2 各组细胞周期、凋亡率比较 HepG2细胞:实验1组及对照1组 G0/G1期细胞比例分别为73.15%、59.75%，两组比较，P＜0.05;SMMC-7721细胞:实验2组及对照2组G0/G1期细胞比例分别为76.66%、44.11%，两组比较，P＜0.05。HepG2细胞:实验1组及对照1组细胞凋亡率分别为22.53%、5.20%，两组比较，P＜0.05;SMMC-7721细胞:实验2组及对照2组细胞凋亡率分别为17.63%、4.80%，两组比较，P ＜0.05。

2.3 各组细胞TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表达比较 实验1组 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表达量分别为9.01±0.71、9.14±0.61、7.41±0.05，对照1组分别为8.23±0.24、8.46±0.13、8.41±0.11，两组比较，P 均 ＜0.05;实验 2 组 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA表达量分别为9.68±0.12、9.34±0.64、8.30±0.18，对照 2组分别为 7.84±0.12、8.23±0.12、8.65±0.35，两组比较，P 均 ＜0.05。

2.4 各组细胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白表达比较 实验1组 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表达量分别为(141.90±7.69)、(145.8±14.70)、(27.51±1.38)pg/mL，对照1组分别为(36.49±4.20)、(43.01±1.50)、(48.27±7.70)pg/mL，两组比较，P 均 ＜0.05;实验2 组 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表达分别为(178.50±17.77)、(201.40±18.65)、(24.18±3.44)pg/mL，对照2组分别为(43.15±1.77)、(41.01 ±0.64)、(45.60 ±3.91)pg/mL，两组比较，P均＜0.05。

3 讨论

肝癌是一种富含血管的实体性肿瘤，全世界每年约有75万新发肝癌患者，并约有70万患者死于肝癌。早期肝癌患者可进行手术治疗或肝移植治疗，但其复发率仍然很高，晚期肝癌患者缺少有效的治疗方法。肝癌的发生涉及多种细胞因子和信号通路，目前针对分子靶点的靶向治疗成为研究热点［1］。

明矾是一种常见的中药，主含含水硫酸铝钾，具有收湿敛疮、止血化腐作用，外用能解毒杀虫、燥湿止痒，内服可利胆、止血止泻、祛除风痰［14］。在我国，明矾主要产于甘肃、安徽、山西、湖北、浙江等地［15］。现代医学研究发现，明矾可以治疗内痔、脱肛、子宫脱垂，对控制烧伤创面绿脓杆菌感染有效，亦可治疗慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡、传染性肝炎［5～15］。

TGF-β1信号通路作用复杂，在肿瘤早期其可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，发挥抑制肿瘤的作用［2，3］。在肝癌细胞中，以 TGF-β1处理肝癌细胞HepG2和Huh7，48 h后增殖细胞核抗原显著下降，而Caspase-3、细胞色素C则明显升高，并且IFNα2b可增强此效应，说明TGF-β1/Smad信号通路可抑制肝癌细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［4］。但是，在肿瘤发生发展过程中，TGF-β1受体 TGFβR 的突变［16］以及TGF-β1信号通路突变［17］常导致肿瘤细胞对TGF-β1的抑制作用不敏感。研究［17］表示，37% ～70%的肝癌组织中存在TβRⅡ表达下降，酪氨酸激酶受体C可通过与TGFβRⅡ结合而抑制TGF-β1信号通路功能发挥，并促进肿瘤的发生、侵袭和转移［18］，而 Smad2、4 发生基因突变［19～22］等亦可导致肝癌细胞内TGF-β1抑制信号通路的失活。因此，重新修复TGF-β1信号通路的抑制作用，是一种新的治疗肝癌的方法。在明矾治疗肝炎作用机制的研究中发现，其抑制肝细胞损伤和纤维化作用与TGF-β1相关。因此，我们推测明矾能够激活修复TGF-β1信号通路，进而发挥抗肿瘤作用。本研究显示，明矾能够抑制肝癌细胞的增殖，并且呈时间和剂量依赖性，并且明矾能够把肝癌细胞阻滞在G1期，并进一步促进细胞凋亡。

Cyclin E是G1期细胞周期素，是细胞从G1期向S期转换的主要限速因素之一［23］。p21是细胞周期抑制蛋白Cip/Kip家族中的一员，是目前所知最广泛的细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子之一，p21与 CDK2结合，通过竞争性抑制作用阻止Cyclin E、CDK2结合，抑制Cyclin E-CDK2复合物的活性，进而使Rb蛋白无法被磷酸化，从而不能释放转录因子，而使细胞生长停滞于 G1期［24］。p21基因是TGF-β1信号通路的下游调节基因，在TGF-β1抑制肿瘤作用中发挥关键作用。在TGF-β1经典的Smad依赖性通路中，TGF-β1在 TβRⅢ辅助下，与TβRⅡ受体结合，TβRⅡ通过转磷酸化作用磷酸化TβRⅠ，进一步促进Smad2、3，与Smad4结合后进入胞核，促进p21基因转录［3］。转录表达的p21蛋白通过抑制Cyclin E/A-CDK2复合体的形成，将细胞阻滞于G1期［18］。明矾作用于肝癌细胞株后，细胞内TGF-β1、p21表达增加，Cylin E 表达降低，说明明矾活化了肝癌细胞株的TGF-β1/Smad/p21通路，从而导致细胞阻滞在G1期，进而引起细胞凋亡。

总之，明矾能够抑制肝癌细胞增殖，使肝癌细胞阻滞于G1期，并促进其凋亡，其机制可能与促进TGF-β1、p21表达及下调Cyclin E表达有关。

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