miR-93转染对胃癌细胞株SGC-7901侵袭迁移能力的影响及机制探讨

miR-93转染对胃癌细胞株SGC-7901侵袭迁移能力的影响及机制探讨

赵立刚，姜维民，董茂盛

(中国人民解放军第二炮兵总医院，北京100088)

摘要：目的观察上调miR-93表达对人胃癌细胞株SGC-7901侵袭迁移能力的影响，并探讨其可能机制。方法将miR-93模拟物及其阴性对照物分别转染胃癌细胞株SGC-7901，qRT-PCR检测转染细胞的miR-93，细胞划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测转染细胞的迁移及侵袭能力，qRT-PCR和Western blotting检测转染细胞的染色体质域解螺旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)mRNA和蛋白。结果与转染阴性对照物的SGC-7901细胞相比，转染miR-93模拟物的SGC-7901细胞miR-93表达明显增加(P<0.01)、迁移和侵袭能力增强(P均<0.05)、CHD5 mRNA及蛋白表达下调(P均<0.05)。结论 过表达miR-93可促进SGC-7901细胞的迁移和侵袭，其机制可能与CHD5表达下调有关。

关键词：微小RNA；微小RNA93；胃癌；胃癌细胞株SGC-7901；染色体质域解螺旋酶DNA结合蛋白5；癌细胞迁移；癌细胞侵袭

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.011

中图分类号：R735.2文献标志码：A

收稿日期：(2015-08-24)

通信作者：董茂盛

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率高，病死率占我国肿瘤相关死亡率的第4位[1]，复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。因此，寻找一种特有的、能够早期阻断胃癌细胞浸润和转移的靶向分子，对于胃癌的治疗具有重要意义。microRNAs(miRNAs) 是一类非编码单链RNA，包含19～25个核苷酸，通过与靶基因3′非翻译区结合而抑制靶基因的翻译，影响其蛋白表达，发挥癌基因或抑癌基因的作用[2]。过表达miR-93能够促进食管癌细胞[3]、鼻咽癌细胞[4]、胶质瘤细胞[5]的增殖及迁移。染色体质域解螺旋酶DNA结合蛋白5 (CHD5)是近年来发现的一种抑癌基因，CHD5在肝细胞肝癌[6]、胰腺癌[7]、胆囊癌[8]等多种肿瘤组织中呈低表达甚至表达缺失，提示CHD5在肿瘤的发生过程中起到了重要作用。2015年5月10日～6月31日，我们将miR-93模拟物(miR-93mimics)转染胃癌细胞株SGC-7901，检测细胞迁移和侵袭能力、CHD5 mRNA及蛋白，观察过表达miR-93对SGC-7901细胞迁移及侵袭能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂细胞：人胃癌细胞株SGC-7901由中国人民解放军第二炮兵总医院中心实验室惠赠。主要试剂：DMEM及Opti-MEM培养基(Gibco, 美国)，胎牛血清、LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美国)，CHD5兔抗人单克隆抗体及山羊抗兔二抗、α-Tubulin鼠抗人单克隆抗体及山羊抗鼠二抗(Santa Cruz, 美国)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(北京天根)，miR-93 mimics及阴性对照、RNA提取试剂TRIzol、 qRT-PCR探针及引物试剂盒(苏州吉玛)，Transwell小室(Corning，美国)，Matrigel基质胶(BD，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及miR-93转染将SGC-7901细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、95% CO2培养箱中常规培养，每3～4 d换液1次，取对数生长期细胞进行实验。将对数生长期SGC-7901细胞接种于6孔板并分为两组，待细胞生长至70%左右融合时进行转染：miR-93 mimics转染组(SGC-7901-miR-93组)加入LipofectamineTM2000、Opti-MEM及miR-93 mimics(终浓度100 nmol/L)；转染miR-93阴性对照物的阴性对照组(SGC-7901-NC组)加入LipofectamineTM3000、Opti-MEM及miR-93阴性对照质粒(终浓度100 nmol/L)。质粒转染按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行。转染后两组细胞均在在培养箱中培养6 h，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。

1.2.2SGC-7901细胞miR-93检测采用qRT-PCR。分别收集转染48 h的两组细胞，用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA。qRT-PCR套装试剂盒进行逆转录及PCR反应。定量PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性12 s，62 ℃退火延伸35 s，扩增40个循环。以U6作为内参。引物序列：miR-93上游引物为5′-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3′,下游引物为5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6上游引物为5′-GCACCCGTCCAAGAGAGTC-3′，下游引物为5′-GGTTCCATCCGTACAGCCT-3′。每个反应设3个复孔。miR-93相对表达量用ΔCt表示，升降倍数=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93组-ΔCtSGC-7901-NC组。

1.2.3SGC-7901细胞侵袭能力检测采用Transwell实验。Matrige1胶用预冷的无血清DMEM培养基1∶1稀释后，均匀涂于8 μm小孔聚碳酸酯滤膜的Transwell小室内，37 ℃静置30 min。收集转染48 h的两组SGC-7901细胞。分别于Transwell小室的上室接种无血清DMEM培养基重悬的两组SGC-7901细胞(1×105/mL)悬液200 μL，下室加入含10%FBS的DMEM培养基800 μL；继续培养24 h后取出Transuell小室，用棉签轻轻擦去小室底部未穿过基底膜的细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。倒置显微镜下计数穿过小室基底膜的细胞数，每个小室随机选取10个视野进行计数。

1.2.4两组SGC-7901细胞迁移能力检测采用划痕实验。实验分组同前，首先于6孔板背侧每隔0.5 cm用Mark笔划一横线，横穿过孔，每孔至少划5条线。两组细胞转染48 h，用微量枪头(200 μL)垂直6孔板背侧的横线划痕。PBS洗去划下的细胞，加入无血清DMEM培养基。继续培养，分别于培养24、48 h后取样拍照，采用Image J 测量细胞覆盖率，以比较细胞迁移的速度。

1.2.5SGC-7901细胞CHD5 mRNA及蛋白检测①CHD5 mRNA检测：采用qRT-PCR。分别收集转染48 h的两组SGC-7901细胞，用TRIzol抽提各组细胞总RNA。qRT-PCR套装试剂盒进行逆转录及PCR反应。定量PCR反应条件为95 ℃ 预变性3 min，95 ℃变性12 s，62 ℃退火延伸35 s，扩增40个循环。以β-actin作为内参。引物序列：CHD5上游引物为5′-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC-3′，下游引物为5′-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG-3′；β-actin上游引物为5′-CGTGGACATCCGCAAAGA -3′，下游引物为5′-GAAGGTGGACAGCGAGGC-3′。每个反应设3个复孔。CHD5 mRNA相对表达量用ΔCt表示，升降倍数=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCtSGC-7901-miR-93组-ΔCtSGC-7901-NC组。②CHD5蛋白检测：采用Western blotting。分别收集转染48 h的两组SGC-7901细胞，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，各取50 μg蛋白上样,10%的SDS-PAGE电泳，半干转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，用抗CHD5抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，以α-Tubuli作为内参，再用相应的二抗(1∶2 000)室温下孵育1 h，PBST洗膜10 min×3 次，配置新鲜发光液，将膜孵育3min，暗室X线片曝光1-5 min，显影1 min，定影30 s成像。采用Image lab检测条带灰度值，以此表示CHD5蛋白的相对表达量。

2结果

2.1两组SGC-7901细胞的miR-93表达比较SGC-7901-miR93组、SGC-7901-NC组SGC-7901细胞的miR-93相对表达量分别为5.37±0.43、9.01±0.61；与SGC-7901-NC组相比，SGC-7901-miR93组SGC-7901细胞的miR-93表达上调11.34±2.23倍，两组相比，P<0.01。

2.2两组SGC-7901细胞的侵袭能力比较SGC-7901-miR93组穿过小室基底膜的细胞数为(99.76±10.41)个/HP，SGC-7901-NC组穿过小室基底膜的细胞数为(56.38±7.82)个/HP，两组相比，P<0.05。

2.3两组SGC-7901细胞的迁移能力比较SGC-7901-miR93组、SGC-7901-NC组细胞覆盖率分别为82.63%±9.14%、48.71%±5.28%，与SGC-7901-NC组相比，SGC-7901-miR93组SGC-7901细胞的迁移能力提高了43.51%，两组相比，P<0.05。

2.4 两组SGC-7901细胞CHD5 mRNA及蛋白表达比较SGC-7901-miR93组、SGC-7901-NC组CHD5 mRNA的相对表达量分别为10.01±1.02、9.24±0.89，与SGC-7901-NC组相比，SGC-7901-miR93组SGC-7901细胞CHD5 mRNA的表达下降了0.39±0.05倍，两组相比，P<0.05。SGC-7901-miR93组、SGC-7901-NC组CHD5蛋白表达量分别为0.46±0.06、0.25±0.04；与SGC-7901-NC组相比，SGC-7901-miR93组SGC-7901细胞CHD5蛋白表达下降了48.77%，两组相比，P<0.05。

3讨论

miRNAs主要通过与靶基因3′端非翻译区完全或不完全互补来降解靶基因或抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达调控，参与细胞生长、发育、分化、凋亡及增殖等一系列生命活动过程[9]。Liu等[10]研究发现，miR-29a在胃癌组织中的表达量明显低于癌旁正常组织，同时过表达miR-29a能够显著抑制胃癌细胞的侵袭和转移。提示miR-29a在胃癌中起着抑癌基因的作用。Zhang等[11]研究发现，miR-107在肝癌组织及肝癌细胞中的表达量显著高于癌旁正常组织及正常肝细胞，且过表达miR-107能促进肝癌HepG2细胞增殖，提示miR-107在肝癌中发挥着癌基因的作用。目前，胃癌的miRNA研究主要应用于胃癌早期诊断的分子标志物、分子靶向治疗靶点、肿瘤的耐药性及疾病转归的预测等方面[12]。Fu等[13]利用qRT-PCR方法检测胃癌、慢性萎缩性胃炎及健康人群血清中的miR-222，发现胃癌患者血清中miR-222表达量明显升高，ROC曲线显示其敏感度66.1%、特异性为88.3%，且Kaplan-Meier生存分析提示血清中miR-222表达量越高的患者，其无病生存率及总生存率越低。Chen等[14]利用qRT-PCR方法检测158例胃癌组织和癌旁正常组织中的miR-93，发现128例胃癌组织中miR-93的表达量显著高于癌旁正常组织，且miR-93的表达与肿瘤的分期、浸润深度及淋巴结转移数目显著相关，癌组织中miR-93高表达的患者总生存期及无病生存期均显著短于低表达者。提示miR-93在胃癌中发挥着癌基因的作用。本研究采用脂质体法转染miR-93 mimics以上调miR-93的表达,结果显示过表达miR-93能显著增强SGC-7901细胞的迁移及侵袭能力。这一结果提示miR-93在胃癌中可能发挥着类似癌基因的作用。

为了进一步研究miR-93的功能及其在胃癌中的可能作用机制，我们检索了microRNA.org等生物信息学网站，预测CHD5可能是miR-93的靶基因。CHD5是CHD蛋白家族的第5个成员，是2007年由Bagchi等采用染色体基因工程技术首次证实的一种抑癌基因，CHD5通过调控p19arf/p53通路以调节细胞增殖和凋亡，还可以调节ras基因而抑制正常细胞发生恶变[15]。CHD5在多种恶性肿瘤组织中低表达甚至表达缺失，包括乳腺癌[16]、肺癌[17]及结直肠癌[18]等。Wang等[19]研究发现，CHD5基因在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，在胃癌的7种细胞系中CHD5基因同样出现低表达甚至表达沉默；进一步研究发现过表达CHD5能够显著抑制胃癌细胞的生长，证实了CHD5在胃癌的发生发展中起着抑癌基因的作用。本研究发现，SGC-7901细胞转染miR-93 mimics后，其CHD5 mRNA和蛋白表达量均显著降低。因此，推测miR-93可能通过靶向抑制CHD5的表达在胃癌中发挥癌基因的作用。

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