非霍奇金淋巴瘤患者外周血及骨髓中免疫球蛋白、T细胞受体基因重排检测的意义

丁士华，熊述道，翟志敏，秦慧，陶莉莉

(安徽医科大学第二附属医院，合肥 230061)

淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体通过基因重排形成有功能的基因。1个T、B细胞或其克隆性后代均只含1种独特的分子遗传学标记，一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］。因此，免疫球蛋白(Ig)及T细胞受体(TCR)基因作为淋巴细胞单克隆增殖的主要分子标志，可作为判断是否存在恶性克隆的标准。为此，我们应用PCR方法检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)中 Ig及 TCR基因重排情况，并探讨其在MHL诊断、分期、预后等方面的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年6月～2013年12月本院经病理确诊NHL患者60例，男34例、女26例，年龄19～82岁、中位年龄47岁。其中41例为B细胞淋巴瘤，19例为T细胞淋巴瘤。根据AnnArbor标准确定临床分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)14例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)46例;按2010年WHO分类确定病理组织学恶性程度，低度恶性11例，中、高度恶性49例。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 收集患者治疗前外周血及骨髓标本，单个核细胞分离按常规方法进行，RNA提取和cDNA合成应用TRIZOL试剂盒，并应用随机引物和反转录酶试剂盒反转录合成cDNA第1链;均按常规方法进行。①BIOMED-2引物系统:根据文献［2］设计的引物组合共有14管97对引物，包含了IgH(A、B、C、D、E 共 5 管)、Igκ(A、B 共 2 管)、IgL(1管)、TCRβ(A、B、C 共 3 管)、TCRγ(A、B 共 2管)。这些引物组合后应用于检测Ig重链(H)、轻链(κ 和 λ)、TCRβ、TCRγ、TCRδ 基因重排;IgH 分成5 组:IgH-A、B、C、D、E;Igκ 分成 2 组:Igκ-A、B;TCRβ 分成 3组:TCRβ-A、B、C。TCRγ 分为 2组:TCRγ-A、B。所有引物由上海生工生物技术有限公司合成，采用相同的扩增条件和检测方法，PCR实验阳性对照为已知发生单克隆性基因重排的淋巴瘤病例;阴性对照为非淋巴瘤患者;空白对照以双蒸水代替模板进行扩增。②PCR反应体系及反应条件:扩增采用25 mL反应体系:10×缓冲液2.5 mL，25 mmoL/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP0.5 μL，模板DNA 100 ng，每条引物10 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，余用双蒸水补足。反应条件:94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，扩增35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃放置。样本DNA均扩增β-actin基因作为内参照。③聚丙烯酰胺凝胶电泳:取5～10 μL PCR产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后，紫外透射仪下照相、观察。

1.2.2 统计学方法 采用 SPSS18.0统计软件，率以百分比表示，比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 B、T细胞Ig及TCR基因重排阳性率 41例B细胞NHL中，出现IgH基因重排16例，其中IgH和TCR双重重排1例，IgH基因重排阳性率为39.02%。19例T细胞NHL有7例扩增出TCR基因重排带，基因重排阳性率为36.84%。B、T细胞NHL Ig及TCR基因重排阳性率比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 不同分期、不同恶性度NHL患者Ig及TCR基因重排阳性率 NHL基因重排阳性率在早期和晚期患者中分别为 28.57%(4/14)及41.30%(19/46);低度恶性 NHL(包括B系的FL及 MALT)与中、高度 NHL(除 FL、MALT的 B-或 T-NHL)Ig及TCR基因单克隆重排阳性率分别为36.36%(4/11)和38.78%(19/49);不同分期、不同恶性度患者基因重排阳性率差异无统计学意义(P均＞0.05)。

2.3 基因重排与骨髓侵犯 对53例NHL骨髓标本进行骨髓涂片形态学检查，异形淋巴细胞≥5%为骨髓侵犯。结果53例NHL患者中有6例检出骨髓侵犯(其中4例为Ⅳ期B-NHL、2例为Ⅳ期T-NHL)，阳性率为11.32%，低于骨髓Ig及TCR基因重排检测的阳性率37.73%(20/53)，两者比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。

2.4 外周血与骨髓Ig及TCR基因重排 53例同时行骨髓及外周血检测，其骨髓Ig及TCR基因重排的阳性率37.73%(20/53)，而外周血Ig及TCR基因重排的阳性率为30.19%(16/53)，两者差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.5 随访结果 对14例NHL患者化疗前后骨髓标本进行了跟踪观察，化疗前骨髓基因重排均有阳性带，经化疗后均达到临床完全缓解，但检测重排带与临床不完全一致，3例仍有基因重排阳性带。其中1例为弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤Ⅳ期，1例为套细胞淋巴瘤Ⅳ期，1例为外周T细胞性淋巴瘤Ⅲ期。弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤化疗前IgH重排阳性，CHOP化疗达到临床完全缓解后，复查IgH重排仍阳性，给予R-ECHOP强化巩固治疗。治疗结束复查基因重排无阳性带，现已无复发存活1.5年。T细胞淋巴瘤化疗前TCR阳性，化疗达临床完全缓解后，TCR重排检测仍阳性;患者治疗结束后迅速复发，给予二线化疗方案治疗，疗效差，现已死亡(从确诊到死亡仅11个月)。外周T细胞性淋巴瘤出院时与入院基因重排检测均出现TCR阳性带，出院后于短期内(45 d)复发并侵及颅内，进展为Ⅳ期，给予Hyper-CVAD方案，并行鞘内注射(Ara-C/MTX)，现存活22个月。

3 讨论

基因重排是淋巴细胞发育成熟的一个正常生理过程。淋巴细胞从原始胚系构型到分化成熟，基因组上彼此分离的DNA片段通过重组才能形成有功能的基因，进而表达抗原受体，即Ig和 TCR［3］。正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的Ig或TCR基因重排，即表现为重排基因为单一模式，它是克隆性增生和谱系来源的标志，已被公认为淋巴瘤诊断、鉴别诊断和治疗后监测的重要指标［4，5］。

本研究采用Ig和TCR基因重排的克隆性分析，覆盖了绝大部分的功能性基因片段，所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，操作性强，具有很高的敏感性和特异性。尽管如此，本结果显示的骨髓和外周血Ig及TCR基因重排阳性率远低于相关报道［6～8］，考虑与不同类型 NHL 本身的增殖、播散特点有关。NHL早期以局限于结内病变为主，进展期或晚期才出现结外或骨髓浸润，导致了Ig及TCR基因重排阳性率的差异。

本研究还出现1例免疫组化确定为B细胞来源的淋巴瘤具有IgH和TCR两种重排的病例，这种现象被称为序列失真现象［9］。目前认为该现象的产生是由于Ig和TCR基因既具有同源性，又有相同的重组酶。当发生重排的调节机制异常时，相同的重组酶就可以将两个基因错误地进行重排。尽管IgH或TCR进行了错误重排，但其他标志性表面抗原不会改变，结合免疫组化检查仍可确定为B或T细胞来源，故在区分B细胞与T细胞来源时，一定要结合细胞形态学和免疫组织化学，而不能单纯地应用基因重排类型来确定。

骨髓涂片及活检是目前临床上判断NHL是否侵犯骨髓的常用方法。由于受瘤细胞的分布特点(灶性)及抽吸负压被血液稀释，或因骨髓网状纤维含量增加及瘤细胞致密等因素的影响，抽吸取材假阴性率较高，且常因肿瘤细胞数目少、与周围正常的细胞形态相似而容易导致漏检。本研究中患者骨髓涂片检查发现骨髓侵犯的阳性率明显低于Ig、TCR基因单克隆重排阳性率。因此多重PCR检测有利于肿瘤细胞比例低于5%的骨髓微小转移的发现，可用于早期发现淋巴瘤的骨髓侵犯及治疗后的骨髓复发［10］。

本研究提示，单克隆基因重排阳性率在不同临床分期和恶性程度的NHL中差异无统计学意义，表明NHL可能早期已有骨髓转移，低度恶性NHL也具有相当高的单克隆基因重排阳性率，这比传统的AnnArbor分期更能反映NHL的本质，说明NHL为全身弥漫性疾病，其治疗原则支持以化疗为主的全身治疗。

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