重症肌无力患者血清乙酰胆碱受体抗体分类及自身抗体的检测方法

李翠兰，石其光

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是主要累及神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR） 由 B 细胞 /自身抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与的自身免疫性疾病［1，2］。 近年来，AChR 抗体的检测方法得到了很大发展，灵敏度和特异性也有了提升。但仍有一部分MG患者血清AChR抗体阴性，研究发现部分AChR抗体阴性的MG患者血清中含有特异性针对肌肉特异性受体酪氨酸激酶 （muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK）及低密度脂蛋白受体相关蛋白 4（low－density lipoprotein receptor－related protein 4，LPP4）的抗体。

1 血清AChR抗体阳性MG

目前认为，AChR是大多数MG患者的特异性自身抗原，分为两种亚型，胚胎型AChR由α2、β、δ、γ亚基组成，主要存在于胎儿的肌肉中，出生后γ亚基逐渐被ε亚基取代，称为成熟型AChR，其由α2、β、δ、ε亚基组成［3］。 目前认为在成人骨骼肌中只有眼外肌同时表达成熟型和胚胎型AChR亚单位，其他骨骼肌只表达成熟型亚单位［4］。乙酰胆碱受体有两个乙酰胆碱结合位点，分别位于α与γ或ε，α与δ之间［3］。主要免疫原区域位于α亚基的67～76位氨基酸残基［5］。因此重症肌无力患者血清中主要含有针对AChR－α亚基的抗体［6］。但后来研究发现，另有少部分患者含有特异性针对AChR－γ和AChR－ε 的抗体［7］。 AChR 抗体类型为 IgG，主要亚型为IgG1和IgG3［8］。抗体发挥作用可能有3种机制［9］，即：①补体固定并激活引起突触后膜溶解导致含AChR的膜损伤、释放AChR－抗体—补体复合物至突触间隙；②可能通过蛋白质的环链和内在化调节AChR数量；③抗AChR抗体直接与AChR结合引起功能阻滞。

2 血清AChR抗体阴性MG

2.1 MuSK抗体阳性MG MuSK是表达于骨骼肌神经肌肉接头的酪氨酸激酶受体，胞外区有4个Ig样区域和1个半胱氨酸聚集区组成，胞内区有1个激酶区、近膜区和羧基末端尾部组成［10］。其功能是运动神经释放的聚集蛋白（Agrin）同肌肉细胞表面的MuSK受体接触，活化MuSK，引起细胞支架蛋白（Rapysn）聚集，然后Rapysn启动AChR和和表皮生长因子受体（erbBR），促使骨骼肌表面突触后膜上AChR 聚集［11，12］。 肌肉活检发现 MuSK－Ab 阳性的MG患者，神经肌肉接头处的AChR数量较正常组无明显差异。这一点同AChR抗体阳性的MG患者不同，后者AChR数量明显减少。MuSK－Ab主要通过与MuSK的胞外区结合后，抑制AChR聚集相关蛋白的功能，进而抑制AChR在突触后膜的聚集，影响神经肌肉接头信息传递［13］。同AChR－Ab主要由 IgG1型 IgG3型组成不同，MuSK－Ab主要为IgG4型，其发挥作用并不通过激活补体。所以通常在MuSK－Ab阳性的MG患者神经肌肉终板上并无补体 C3 的沉积［7］。

2.2 低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LPP4）抗体阳性MG 尽管目前血清AChR抗体检测方法的敏感性和特异性较以往有了较大的提高，但是仍有近5%～10%的MG患者血清AChR抗体和MuSK抗体阴性。近年来，低密度脂蛋白受体相关蛋白4已被证实为骨骼肌细胞膜上聚集蛋白（agrin）的受体［14，15］。LPP4表达在神经肌肉突触后膜上，其通过与聚集蛋白的结合从而活化MuSK，在MuSK胞外区域形成细胞支架，招募其他成分组成一个突触后膜的复合体，促使突触后膜上AChR的聚集［16］。2011年，Higuchi等［16］首次在 300例 AChR抗体和 MuSK抗体均阴性的患者血清中发现了9例抗LPP4的抗体，随后于2012年，Higuchi和Waters分别在研究中发现，约50%和9.2%的双抗体阴性的MG患者血清中含有 LPP4 的抗体［16，18］。目前认为，LPP4 的抗体导致肌无力的可能通过以下两种机制干扰突触后膜AChR的聚集：①LPP4的抗体影响聚集蛋白和LPP4结合；②LPP4的抗体影响LPP4和MuSK的相互作用［16］。 研究发现，LPP4的抗体主要为IgG1，通过激活补体而发挥其致病作用［17］。以上研究均表明LPP4作为一种新的自身抗原，在AChR抗体和MuSK抗体均阴性的患者血清中可能含有针对LPP4的抗体。

3 MG中自身抗体的检测方法

3.1 放射免疫沉淀法 （RIPA） 早在1960年人们就认识到重症肌无力是由于患者体内存在抗肌肉终板蛋白自身抗体，到20世纪70年代发现该抗体所针对的靶抗原为AChR。这个发现是归功于环蛇毒素（a－BuTX），它能特异性地结合肌肉AChR。此方法所需的标记有125I－α－银环蛇毒素的AChR抗原最初是来源于去神经支配的骨骼肌，其主要为胚胎型AChR。随着抗原提取方法的不断改进，后来有人将表达AChR－ε的基因转染进TE671细胞，这样TE671细胞可同时表达成熟型和胚胎型两种不同类型的AChR，这进一步提高了AChR抗体检测的敏感性。尽管后来放射免疫法亦广泛用于MuSK抗体的检测，但是其本身具有放射性及其技术缺陷，以后，为避免使用核素，各种非放射性检测方法应运而生。

3.2 非放射性方法 ①酶联免疫吸附测定（ELISA）：此方法主要原理为以α－银环蛇毒素包被酶标板，并与骨骼肌匀浆（含AChR）作用，再加入待测血清和对照血清，最后加HRP标记的二抗，于酶标仪上测492 nm吸光度。以阳性混合血清作为标准血清，制备标准曲线。待测血清中抗AChR抗体含量，可根据吸光度从标准曲线上换算。因为其检测效率较RIPA并未提高，因此此方法并未被常规使用。尽管上述乙酰胆碱受体抗体检测方法不断改进，但是仍有一部分MG患者血清抗体阴性，此外，随着荧光免疫技术的不断成熟，因此一种新的、利用荧光免疫技术检测AChR抗体的方法开始出现。②荧光免疫沉淀法（FIPA）：利用标记有荧光蛋白的抗原，此方法最早被用于视神经脊髓炎 （neuromyelitis optica，NMO）中 AQP－4 抗体的检测［19］。 此方法的优点是，可以通过标有不同颜色的荧光蛋白同时进行针对不同抗原的多种抗体的检测。例如，可以对重症肌无力患者同时进行AChR抗体和MuSK抗体的检测。此方法将增强绿色荧光蛋白（EGFP）标记的AChR 4种不同的亚基按照自然比并在聚乙烯亚胺 （PEI）介导下转入人胚肾细胞（HEK－293），后通过裂解细胞来获取标记有EGFP的AChR，使其与待测血清混合，后加入二抗，通过酶标仪读取荧光值来判断结果［2，19］。此方法同RIPA方法具有较高的相关性。③荧光细胞染色方法（CBA）：考虑到传统的RIPA方法，其抗原处于溶液中，且较分散，而神经肌肉接头处的AChR通过聚集蛋白（rapsyn）的连接而以高度密集的状态存在。通常情况下AChR抗体同高度密集表达在细胞表面的AChR结合性最好。因此有人推测血清阴性MG（SNMG）患者中可能含有低亲和力的AChR抗体，这些低亲和力的抗体同溶液中相对分散的AChR不易结合，从而造成那些含有低亲和力抗体的MG患者血清抗体检测结果阴性。2008年，有研究报道首次应用荧光免疫细胞染色技术在66%的“血清阴性”的重症肌无力患者血清中检测出呈低亲和力的AChR抗体［7］。该项检测技术的工作原理及独特之处在于：通过聚集蛋白rapsyn使AChR蛋白的5个亚基聚集并浓缩表达在细胞表面，不仅使抗原抗体的结合反应从传统的放射免疫沉淀法液相环境改进为生长活跃的活性细胞表面，为下一步的荧光显微镜下肉眼观察与抗原结合的抗体提供了直观、形象的读片平台；而且提高了细胞表面反应环境中的抗原浓度，进而增加其与血清中AChR抗体结合能力［2，7］。综上所述，此方法较其他方法更敏感。

目前仍有部分患者临床表现和辅助检查类似MG的患者血清中上述抗体均为阴性。因此对于MG患者血清抗体的检测仍有待于进一步提高，对于MG患者血清中是否还含有针对其他自身抗原的MG相关抗体，目前尚不明确。

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